不同液體容量復(fù)蘇對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的防治作用及機(jī)制探討

陳娜，王樹影，裴凌

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭，病死率為30% ～40%，嚴(yán)重威脅患者的生命［1］。引起 ALI的原因有多種，其中內(nèi)毒素是導(dǎo)致ALI的重要致病因子［2］。研究［3］表明，在失血性休克和感染引起的ALI動物模型中，羥乙基淀粉能減輕肺組織的炎癥反應(yīng)。高滲氯化鈉羥乙基淀粉40注射液是一種高滲晶膠混合液，在補(bǔ)充血容量方面能發(fā)揮很好作用。本研究觀察了不同液體容量復(fù)蘇對大鼠內(nèi)毒素性ALI的防治作用，并探討其可能機(jī)制，旨在為臨床ALI患者液體的選擇提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，6～8周齡。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠分為A、B、C、D、E組各10只。

1.2 主要試劑及儀器 內(nèi)毒素(Sigma公司，美國);氯化鈉溶液(華仁藥業(yè)有限公司);6%羥乙基淀粉130/0.4溶液(Fresenius Kabi公司，德國);高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液(上海華源長富藥業(yè)有限公司);TNF-α試劑盒(Cloud-clone公司，美國);肺表面活性蛋白-D(SP-D)試劑盒(Cloud-clone公司，美國);DFC450光鏡(200×，Leica公司，德國)。

1.3 內(nèi)毒素性ALI模型制備及液體容量復(fù)蘇 A、B、C、D組大鼠麻醉采用腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg。常規(guī)備皮消毒后做氣管切開，保留自主呼吸，行面罩吸氧，氧濃度為60%，流量2 L/min。游離一側(cè)股動、靜脈，分別行穿刺置管術(shù)，靜脈用于給藥和補(bǔ)液，動脈用于采血及通過換能器與多功能監(jiān)測儀相連監(jiān)測平均動脈壓(MAP);參照文獻(xiàn)［4］介紹的方法制備內(nèi)毒素性ALI模型，5 mg/kg內(nèi)毒素溶于0.5 mL生理鹽水中經(jīng)股靜脈緩慢注射1 min。E組給予等量生理鹽水。以氧合指數(shù)≤300 mmHg時(shí)為模型制備成功［5］，后開始液體容量復(fù)蘇，并將此時(shí)作為零時(shí)，分別經(jīng)股靜脈注入高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液(A組)、氯化鈉溶液(B組)、6%羥乙基淀粉130/0.4溶液(C組)，以15 mL/kg恒速輸注6 h;D組不注入任何液體，E組注入等量生理鹽水。

1.4 觀察方法 記錄注射內(nèi)毒素前及液體復(fù)蘇1、3、6 h各組MAP變化。于液體復(fù)蘇6 h時(shí)采集股動脈血0.3 mL進(jìn)行血?dú)夥治觯涗汸aO2、乳酸(Lac)水平，計(jì)算氧合指數(shù)。于上述時(shí)點(diǎn)另取血1.2 mL，4℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清，－80℃保存。采用ELISA方法測定TNF-α、SP-D，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。容量復(fù)蘇6 h后處死大鼠，即刻開胸，結(jié)扎左主支氣管，取下左肺，用蒸餾水沖洗肺表面血液，濾紙吸干表面水分，用電子分析天平稱肺濕重(W)，后置于80℃恒溫烤箱48 h，取出稱干重(D)，計(jì)算濕/干重(W/D)值。在大鼠左肺取出后，即刻行右肺內(nèi)灌注和內(nèi)固定，取下右肺上葉，放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片(4 μm)、脫蠟、蘇木素伊紅(HE)染色、封片后在DFC450光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。按照Mikawa等［6］的方法從四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行肺損傷評分:①肺泡充血;②出血;③間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集;④肺泡間隔增厚或透明膜形成;根據(jù)每項(xiàng)指標(biāo)病變輕重進(jìn)行0～4分半定量分析(0:無或極輕微損傷;1:輕度損傷;2:中度損傷;3:重度損傷;4:極重度損傷)，累加各項(xiàng)評分的總分作為ALI的病理評分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MAP水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MAP水平比較(mmHg，±s)

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MAP水平比較(mmHg，±s)

注:與E組比較，*P＜0.05;與 D組比較，#P＜0.05;與 B組比較，ΔP ＜0.05。

組別MAP注射內(nèi)毒素前 液體復(fù)蘇1 h 液體復(fù)蘇3 h 液體復(fù)蘇6 h A組 105±5 88±3*#Δ 82±2*#Δ 79±4*#Δ B組 102±6 76±4*# 65±4*# 56±3*#C組 103±8 88±5*#Δ 80±3*#Δ 79±4*#Δ D組 101±7 65±6* 54±5* 42±7*E組103±3 103±5 101±5 100±4

2.2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數(shù)及TNF-α、SP-D、Lac水平比較 結(jié)果見表2。

2.3 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 E組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔中無滲出液或滲出的中性粒細(xì)胞;D組雙肺明顯水腫，肺泡結(jié)構(gòu)完整性遭到嚴(yán)重破壞，彌漫性中性粒細(xì)胞滲出、聚集;B組肺組織破壞嚴(yán)重，大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見滲出液;C組和A組肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，出血和中性粒細(xì)胞浸潤情況較B組明顯減輕。

表2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數(shù)及TNF-α、SP-D、Lac水平比較(±s)

表2 各組大鼠W/D值、肺損傷評分、PaO2、氧合指數(shù)及TNF-α、SP-D、Lac水平比較(±s)

注:與 E 組比較，*P ＜0.05;與 D 組比較，#P ＜0.05;與 B 組比較，ΔP ＜0.05;與 C 組比較，☆P ＜0.05。

組別 W/D值 肺損傷評分(分) PaO2(mmHg) 氧合指數(shù)(mmHg)TNF-α(pg/mL) SP-D(ng/mL) Lac(mmol/L)A 組 4.54 ±0.14*#Δ 3.7 ±1.5*#Δ 129 ±16*#Δ 215 ±27*#Δ 32.4 ±1.2*#Δ 31.6 ±2.3*#Δ 2.52 ±0.19*#Δ☆B 組 5.08 ±0.09*# 10.1 ±2.3*# 92 ± 6*# 154 ± 9*# 52.6 ±3.1*# 47.3 ±1.7*# 3.90 ±0.21*#C 組 4.56 ±0.13*#Δ 4.9 ±1.5*#Δ 132 ±16*#Δ 219 ±27*#Δ 34.1 ±1.3*#Δ 32.2 ±2.6*#Δ 3.29 ±0.23*#Δ D 組 5.97 ±0.16* 11.3 ±1.2* 73 ± 4* 122 ± 8* 64.2 ±2.4* 69.5 ±3.6* 4.72 ±0.25*E 組 4.08 ±0.08 0.5 ±0.5 207 ± 6 346 ±10 24.0 ±0.7 13.9 ±1.1 1.65 ±0.21

3 討論

ALI/ARDS可由直接肺損傷(如肺炎、胃內(nèi)容物的吸入和有毒物質(zhì)的吸入)和間接肺損傷(如膿毒血癥、創(chuàng)傷性休克、輸血和急性胰腺炎)引起，其中最常見的原因是細(xì)菌或病毒性肺炎［7］。ALI/ARDS患者的病死率極高，需要積極治療。目前認(rèn)為，液體治療是肺損傷治療的第一步，也是最基本的治療方案。相對于晶體，膠體能有效提高血漿膠體滲透壓，維持血容量。在ALI早期，機(jī)體處于低心排血量和低灌注狀態(tài)，采用積極地液體復(fù)蘇策略可以補(bǔ)充血容量，增加心排血量，改善組織灌注。

ALI/ARDS患者由于彌漫性肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷常導(dǎo)致肺組織水腫，從而表現(xiàn)為頑固性低氧血癥和血流動力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)。本研究顯示，E組大鼠各時(shí)點(diǎn)MAP平穩(wěn)，PaO2、氧合指數(shù)正常;D組大鼠在給予內(nèi)毒素后隨著時(shí)間延長MAP、PaO2和氧合指數(shù)進(jìn)行性下降;而A、B、C組大鼠MAP、PaO2和氧合指數(shù)盡管也有下降，但與D組比較，下降程度得到改善，尤其是A、C組。A、B、C組W/D值明顯低于D組，尤其是A、C組。上述結(jié)果說明，上述三種液體(尤其是后兩種)均可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)毒素引起的MAP、PaO2和氧合指數(shù)下降，減輕肺組織水腫，改善大鼠組織氧供，使大鼠血流動力學(xué)更加穩(wěn)定，從而有可能減少其他并發(fā)癥的發(fā)生。

SP-D主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞合成并分泌至肺泡表面，有助于維持肺組織表面活性物質(zhì)水平的穩(wěn)定，參與免疫防御和下調(diào)炎癥反應(yīng)，因此其在ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［8，9］。動物實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)毒素導(dǎo)致的ALI模型，在SP-D缺乏型小鼠和SP-D正常型小鼠的對比研究中，SP-D通過抑制粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子途徑，抑制外周單核/巨噬細(xì)胞向肺內(nèi)遷移，從而抑制炎癥反應(yīng)［10］。Liu等［11，12］將人類 SP-D 重組體作用于變應(yīng)原攻擊后的小鼠，發(fā)現(xiàn)SP-D能抑制TNF-α的產(chǎn)生，其機(jī)制可能是SP-D作用于CD14/toll樣受體，阻斷病原體的刺激而發(fā)揮抗炎作用。在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ALI動物模型中，將含有SP-D的肺表面活性物質(zhì)注入氣管后，電鏡觀察到肺泡巨噬細(xì)胞的溶酶體結(jié)構(gòu)內(nèi)含有SP-D與內(nèi)毒素的聚集體，結(jié)果表明SP-D能減輕內(nèi)毒素的損傷，阻止肺損傷的發(fā)生和發(fā)展［13］。ALI/ARDS發(fā)生后，肺毛細(xì)血管膜完整性遭到破壞，通透性增加，導(dǎo)致肺泡表面的SP-D向血管內(nèi)滲漏，使肺內(nèi) SP-D 水平明顯減少［14］。研究［15］顯示，油酸注入肺泡后4 h(病理證實(shí)有呼吸道、肺泡損傷及肺水腫，但可以認(rèn)為無肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增生)測得血清SP-D水平明顯升高。由此SP-D可以作為肺泡上皮細(xì)胞損傷、肺毛細(xì)血管通透性改變的生物學(xué)標(biāo)記物之一，因此監(jiān)測血清SP-D變化有利于指導(dǎo)治療、改善ALI/ARDS患者的預(yù)后。TNF-α是單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的炎性因子，機(jī)體在創(chuàng)傷、燒傷和大手術(shù)等打擊后，體內(nèi)免疫細(xì)胞處于被激活狀態(tài)，首先肺巨噬細(xì)胞被激活，釋放大量的前炎癥細(xì)胞因子，如IL-1和TNF-α，這兩種多功能的因子作用于中性粒細(xì)胞(PMN)和其他細(xì)胞。當(dāng)PMN被激活時(shí)，能產(chǎn)生和釋放活性氧，通過氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)直接損傷肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)PMN還可合成并釋放TNF-α、IL-1等多種炎性因子，導(dǎo)致肺組織損害加重。

本研究顯示，氯化鈉溶液、6%羥乙基淀粉130/0.4溶液和高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液均能降低內(nèi)毒素性ALI大鼠血清SP-D水平，且與肺組織病理變化和血清TNF-α水平變化相一致，而兩種膠體液的容量復(fù)蘇效果更加顯著，其機(jī)制可能是它們能有效維持肺內(nèi)SP-D水平，調(diào)節(jié)SP-D炎癥抑制作用。雖然C組和A組肺損傷程度無顯著性差異，但A組Lac水平低于C組，而對Lac水平的連續(xù)監(jiān)測可以評價(jià)ALI/ARDS的嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后狀況，因此高滲氯化鈉羥乙基淀粉40溶液更適合內(nèi)毒素性ALI的早期容量復(fù)蘇。

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