XIP木聚糖酶抑制蛋白對(duì)不同家族木聚糖酶的抑制作用

■劉新育 王夢(mèng)迪 焦雪苗 郜艷敏 陳紅歌

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

木聚糖是小麥等谷物飼料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，它可以通過(guò)增加動(dòng)物消化道食糜黏度，阻斷細(xì)胞中養(yǎng)分的釋放，降低飼料利用率，最終導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降[1]。因此，如何消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用是影響開發(fā)谷物、糠麩類飼料資源的一個(gè)關(guān)鍵因素。木聚糖酶可以切割主鏈內(nèi)部的糖苷鍵而將木聚糖水解，降解產(chǎn)物分別為低聚木糖或木糖[2]，對(duì)解除木聚糖引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用較為關(guān)鍵[3]。根據(jù)木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域氨基酸的同源性,將其歸為糖苷水解酶GH10家族和GH11家族（http://www.cazy.org/）。

然而Debyser等[4]發(fā)現(xiàn)小麥中存在對(duì)木聚糖酶活性具有抑制作用的蛋白成分，近幾年研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶抑制蛋白在小麥、玉米、水稻、大麥、黑麥、燕麥和高粱中廣泛存在[5]。根據(jù)Gebruers等[6]的估算，小麥中抑制蛋白的含量遠(yuǎn)大于飼料中木聚糖酶的添加量，因此，理論上推測(cè)這些抑制蛋白會(huì)對(duì)外加酶造成負(fù)面影響。由英國(guó)ADAS咨詢公司和Danisco動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)分公司聯(lián)合發(fā)布的英國(guó)國(guó)家糧食局項(xiàng)目的調(diào)查報(bào)告[7]中，建議對(duì)歐洲地區(qū)木聚糖酶抑制蛋白含量較高的小麥品種用作飼料時(shí)，應(yīng)該施加更高用量的木聚糖酶。因此，研究木聚糖酶抑制蛋白對(duì)不同種類木聚糖酶的抑制性質(zhì)，可用來(lái)確定GH10和GH11木聚糖酶中哪一類酶更適合用于飼料添加，以便最大程度地發(fā)揮其酶活性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥木聚糖酶抑制蛋白由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室利用重組畢赤酵母GS115表達(dá)生產(chǎn)，黑曲霉GH10木聚糖酶來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)，哈茨木霉GH11木聚糖酶來(lái)自于市售，山毛櫸木聚糖購(gòu)自Sigma公司。

1.2 主要儀器

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNS反應(yīng)液

取酒石酸鉀鈉182 g，溶于500 ml水中，放入低于50℃水浴中加熱，在熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g、1%的NaOH 20.96 g、苯酚5 g、亞硫酸鈉5 g，攪拌使它們?nèi)芙?，冷卻后定容至1 000 ml，貯藏于棕色瓶中靜置一周后使用。

1.3.2 木聚糖酶和木聚糖酶抑制蛋白的濃度測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)G-250法（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將0.8 ml的蛋白液加入1.6 ml的考馬斯亮藍(lán)溶液，反應(yīng)10 min之后在波長(zhǎng)595 nm下測(cè)定吸光值，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.006 1x+0.082 7通過(guò)代入吸光值y，求出蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 木聚糖酶酶活測(cè)定

取0.1 ml粗蛋白提取液，加入0.1 ml 2%山毛櫸木聚糖（Sigma）底物溶液（用0.2 mol/l、pH值4.6的HAC-NaAC緩沖液配制），在50℃保溫15 min后，立即加入0.6 ml DNS（3,5-二硝基水楊酸）試劑，煮沸10 min顯色，定容至5 ml，于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定還原糖含量(以木糖計(jì))，每個(gè)樣品設(shè)三次重復(fù)。在上述條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（IU）。

1.3.4 木聚糖酶抑制活性的測(cè)定及抑制率的計(jì)算

適當(dāng)稀釋木聚糖酶液，使其木聚糖酶活力測(cè)定OD550nm值在0.6～0.8(相當(dāng)于0.92～1.23 IU木聚糖酶/ml)。取2份0.2 ml的木聚糖酶酶液，一份加入0.2 ml的粗蛋白提取液，另一份加入0.2 ml的0.2 mol/l、pH值7.0磷酸緩沖液，混勻，30℃保溫30 min。從保溫后的2份混合液中分別取0.1 ml測(cè)定其木聚糖酶活力（ODXIP），每個(gè)樣品設(shè)三次重復(fù)。以加入緩沖液的反應(yīng)管中的木聚糖酶活力為對(duì)照（OD0）。抑制率（%）=ODXIP/OD0×100。

1.3.5 抑制蛋白與木聚糖酶的抑制比例測(cè)定

分別測(cè)定抑制蛋白和木聚糖酶的蛋白質(zhì)含量，再根據(jù)各自的相對(duì)分子質(zhì)量換算成摩爾數(shù)。設(shè)定兩者不同的反應(yīng)比例，對(duì)于GH10木聚糖酶，設(shè)置抑制蛋白XIP和木聚糖酶的摩爾比分別為0.25∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1、3∶1；對(duì)于GH11木聚糖酶，設(shè)置抑制蛋白與木聚糖酶的摩爾比依次為0.4∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1；將抑制蛋白與木聚糖酶等體積混合30℃保溫30 min之后測(cè)定木聚糖酶的殘余酶活，對(duì)照用等體積的去離子水代替抑制蛋白。

1.3.6 最佳抑制反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定

將抑制蛋白和木聚糖酶溶液在最適pH值和最適溫度下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min后，測(cè)定木聚糖酶的殘余酶活。

1.3.7 最適抑制溫度的測(cè)定

將抑制蛋白和木聚糖酶溶液等體積混合后，在最適pH值條件下分別在20、30、40、50、60 ℃保溫30 min，測(cè)定木聚糖酶殘余酶活。

1.3.8 最適抑制pH值的測(cè)定

將抑制蛋白和木聚糖酶溶液等體積混勻后加入不同pH值的緩沖液（pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），30℃保溫30 min，之后測(cè)定木聚糖酶的殘余酶活。1.3.9 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠采用12%，濃縮膠采用3%[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母表達(dá)XIP型抑制蛋白的SDS-PAGE

將XIP型抑制蛋白的發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。通過(guò)蛋白遷移率計(jì)算其分子量大約為37 kDa，而通過(guò)序列計(jì)算的理論分子量是30.2 kDa，實(shí)際值比理論值多出6.8 kDa，約占理論分子量的2.2%，由此可判斷極有可能是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抑制蛋白XIP發(fā)生了一定程度的糖基化，導(dǎo)致分子量偏高。

圖1 重組畢赤酵母表達(dá)XIP木聚糖酶抑制蛋白的SDS-PAGE

2.2 XIP型抑制蛋白與木聚糖酶不同摩爾比例對(duì)抑制反應(yīng)的影響

測(cè)定抑制蛋白和木聚糖酶的蛋白濃度后，設(shè)定兩者不同的摩爾比下進(jìn)行反應(yīng)，如圖2、圖3所示。當(dāng)XIP抑制蛋白對(duì)GH10木聚糖酶活性抑制百分比達(dá)到50%時(shí)，抑制蛋白與GH10木聚糖酶的摩爾比大約為1.2∶1。當(dāng)XIP抑制蛋白對(duì)GH11木聚糖酶活性抑制百分比達(dá)到50%時(shí)，抑制蛋白與木聚糖酶的摩爾比大約為8∶1。

圖2 抑制蛋白與GH10木聚糖酶的摩爾比對(duì)XIP抑制蛋白抑制反應(yīng)的影響

圖3 抑制蛋白與GH11木聚糖酶的摩爾比對(duì)XIP抑制蛋白抑制反應(yīng)的影響

2.3 最適抑制溫度的測(cè)定

在不同的溫度下測(cè)定XIP抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的抑制作用，如圖4所示。由圖4可知，XIP對(duì)GH10木聚糖酶和GH11木聚糖酶的最適抑制溫度均為40℃，在30～50℃之間，木聚糖酶抑制蛋白的抑制活性較高。

圖4 不同溫度對(duì)XIP抑制蛋白抑制反應(yīng)的影響

2.4 不同pH值對(duì)XIP抑制蛋白和木聚糖酶抑制作用的影響

在不同的pH值下測(cè)定其抑制活性，將最高的抑制活性作為100%，測(cè)定不同pH值下的抑制率，如圖5所示。由圖5可知，XIP木聚糖酶抑制蛋白對(duì)GH10木聚糖酶和GH11木聚糖酶的最適抑制pH值均為6。在pH值為5～7之間，木聚糖酶抑制蛋白有較高抑制活性。

圖5 不同pH值對(duì)XIP抑制蛋白抑制反應(yīng)的影響

2.5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)XIP抑制蛋白和木聚糖酶抑制作用的影響

將抑制蛋白和木聚糖酶溶液混合反應(yīng)不同時(shí)間，測(cè)定其抑制活性，并計(jì)算抑制率，如圖6所示。由圖6可知，XIP抑制蛋白與GH10木聚糖酶的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化較為平緩，抑制率最大為59.32%，反應(yīng)10 min時(shí)抑制率已達(dá)47.57%，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率變化較為平緩，抑制率最大時(shí)的反應(yīng)時(shí)間是50 min。XIP抑制蛋白對(duì)GH11木聚糖酶的最佳抑制反應(yīng)時(shí)間約為30 min，30 min后抑制活性基本不再改變。

圖6 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)XIP抑制蛋白抑制反應(yīng)的影響

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，XIP抑制蛋白分子量約為37 kDa，高于氨基酸序列計(jì)算所得分子量30.2 kDa，可能是由于該蛋白發(fā)生了糖基化作用。XIP木聚糖酶抑制蛋白分別作用于黑曲霉GH10木聚糖酶和哈茨木霉GH11木聚糖酶，得到最適抑制比例分別為1.2∶1和8∶1，因此對(duì)GH10木聚糖酶具有更強(qiáng)的抑制作用；最適抑制時(shí)間分別是50 min和30 min，最適抑制pH值均為6.0，最適作用溫度均是40℃。因此為了避免麥類飼料中抑制蛋白對(duì)外加木聚糖酶制劑的阻礙作用，飼料中添加GH11木聚糖酶比添加GH10木聚糖酶將會(huì)有較小的酶活力損失，有利于發(fā)揮木聚糖酶的活性，預(yù)計(jì)將會(huì)更好地解除非淀粉多糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。