基質(zhì)金屬蛋白酶-2在血管新生過程中的研究進(jìn)展

趙光賢 樸麗梅（綜述） 成憲武（審校）

基質(zhì)金屬蛋白酶-2在血管新生過程中的研究進(jìn)展

趙光賢 樸麗梅（綜述） 成憲武（審校）

基質(zhì)金屬蛋白酶-2；血管新生；基質(zhì)蛋白；內(nèi)皮祖細(xì)胞

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是 Zn2+、Ca2+依賴的無活性酶原形式存在的肽鏈內(nèi)切酶，是一類有降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）能力的蛋白水解酶家族，在腫瘤細(xì)胞的浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血管新生過程中起到關(guān)鍵作用[1,2]。人類中已識別和定性的MMPs至少有26種，分為5大類。明膠酶A，即基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）為Ⅳ型膠原酶，是蛋白水解酶家族中最常見成員之一。MMP-2以無活性酶原的形式由多種細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞等）分泌[3]，在激活劑的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓拿?。MMP-2可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞間質(zhì)的空隙變大，為腫瘤血管的形成提供有利的空間；還參與協(xié)調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用和局部遷移，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞移動的能力，通過提高血管內(nèi)皮增殖因子（VEGF）間接地參與血管形成，以及作為促進(jìn)血管形成的因子直接參與新生血管的形成。本文對MMP-2在缺血性和非缺血性血管新生過程中的相關(guān)作用綜述如下。

1MMP-2的生物學(xué)特征

MMP-2是相對分子質(zhì)量為72 KD的中性蛋白酶。MMP-2基因位于人類染色體16q21，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，結(jié)構(gòu)基因總長度為27 kb[4]。與其他金屬蛋白酶不同，MMP-2基因5′旁側(cè)序列促進(jìn)子區(qū)域含有2個GC盒而不是TATA盒。MMP-2蛋白中主要含有3個重要的片段，即氨基末端片段、金屬結(jié)合片段及羧基末端片段。氨基末端帶有高度保守序列PRCGV/NPD，具有 1個半胱氨酸殘基，該殘基與激活位點(diǎn)的鋅原子作用調(diào)節(jié)MMP-2前體的激活；金屬結(jié)合片段是目前公認(rèn)的鋅離子結(jié)合部位，其旁側(cè)含有2個組氨酸的保守序列HE-GH；羧基末端具有類似凝血酶結(jié)構(gòu)的片段，但目前該片段的具體功能尚未明確[5]。

活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，主要在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用。

2 MMP-2在血管新生過程中的若干機(jī)制

2.1 MMP-2在缺血后血管新生過程中的干預(yù) 近年來研究指出，MMP參與了炎癥、缺血、創(chuàng)傷后治愈及腫瘤等病態(tài)下的血管新生過程[5-8]。人們對腫瘤血管形成過程中MMP的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制有了較深的了解，但對缺血性血管再生過程中的MMP動態(tài)變化、細(xì)胞的分布及如何調(diào)節(jié)等目前尚不十分清楚。因此，Cheng等[9]利用單側(cè)下肢缺血模型，通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）和酶譜法分析MMP動態(tài)變化。其結(jié)果顯示，在野生型小鼠缺血組織中，術(shù)后第4天MMP-2 mRNA表達(dá)量及其活性明顯增加，1周達(dá)到最高峰并持續(xù)維持了21天。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MMP-2主要分布在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中。酶譜法分析小鼠大動脈環(huán)培養(yǎng)液中蛋白酶活性，結(jié)果表明，主要是MMP-2的明膠分解活性。在血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）刺激下，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的MMP-2 mRNA表達(dá)量明顯高于其他兩種MMPs（MMP-9和MT1-MMP）。以上研究結(jié)果提示，MMP-2在缺血性血管新生中可能起著重要作用。

內(nèi)皮細(xì)胞的游走、浸潤及增殖等一系列細(xì)胞活動在血管新生過程中非常重要[10]。研究表明，明膠酶A（MMP-2）與細(xì)胞膜的ανβ3整合素結(jié)合存在于細(xì)胞膜，參與腫瘤細(xì)胞移動和浸潤[5]。為進(jìn)一步證明MMP-2是否調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能，用byoden chambers法比較了基因敲除小鼠和野生型小鼠大動脈來源皮細(xì)胞的游走能力和浸潤能力。結(jié)果表明，MMP-2缺損小鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子浸潤能力明顯下降，但是游走能力和增值能力無明顯差異。由此可見，MMP-2主要通過血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤為介導(dǎo)來干預(yù)血管新生的過程。

在體內(nèi)試驗(yàn)中，Cheng等[9]使用MMP-2基因敲除的小鼠和野生型小鼠做一側(cè)下肢缺血模型，通過血管造影、激光多普勒、缺血組織切片觀察毛細(xì)血管密度等參數(shù)，并進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)MMP-2基因缺損小鼠側(cè)支血運(yùn)情況及血管新生明顯下降。而且在骨髓細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)，該基因缺損顯著影響骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員、歸巢等功能，并且將MMP-2++的野生型小鼠骨髓移植到MMP-2基因缺損的小鼠上后，其缺血肢體血流及血管新生明顯改善。此研究證明骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了動脈粥樣斑塊及其營養(yǎng)血管的形成過程[11]，從而首次明確了MMP-2通過調(diào)控骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員、歸巢及其功能而促進(jìn)血管生成。另外值得一提的是，MMP-2不是唯一調(diào)控骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動員、歸巢及其功能的蛋白酶，其他的細(xì)胞蛋白酶如組織蛋白酶也參與其中，并起重要作用[12]。有待更多的基礎(chǔ)及臨床研究來進(jìn)一步澄清各種細(xì)胞外蛋白酶在骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動員及歸巢中的相互作用及其機(jī)制。

2.2 MMP-2在血管缺血后及老化中的血管新生機(jī)制 老年人的血管再生功能減退、組織修復(fù)能力低下。近年，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性血管再生過程中，低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）發(fā)揮了重要的作用。HIF-1α是缺氧狀態(tài)下血管生成的核心調(diào)控因子，通過促進(jìn)多種血管生成因子的分泌，從表達(dá)水平、作用時間、作用范圍上協(xié)同調(diào)控，立體調(diào)整缺氧后的血管生成。一些研究提出，衰老很可能與HIF-1α穩(wěn)定性及老年缺血性血管再生功能減退有著密切聯(lián)系。2010年，Cheng等[13]發(fā)現(xiàn)，在缺血骨骼肌組織與老年老鼠細(xì)胞中的HIF-1α穩(wěn)定性和表達(dá)明顯受損。運(yùn)動不僅誘發(fā)PI3K/AKt依賴的HIF-1α激活，同時減弱脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylases）/HIF-1α抑制因子（FIH）介導(dǎo)的HIF-1α的退化。隨著HIF-1α的激活增加，在缺血組織中VEGF、Fit-1及MMP-2等血管生成因子和骨髓造血細(xì)胞的表達(dá)也隨之增高，進(jìn)而促使EPCs增加并促進(jìn)其功能。這種機(jī)制最終導(dǎo)致CD34+/c-Kit+等似EPC細(xì)胞的釋放并參與血管生成，促進(jìn)缺血后的血管新生及血流的回復(fù)。這種IGF-1介導(dǎo)、PI3K/AKt依賴的HIF-1α激活增加的機(jī)制可闡明運(yùn)動在老化引起的心血管疾病中的保護(hù)機(jī)制。由于基因敲除或藥物性MMP-2阻滯劑在一系列試驗(yàn)中的應(yīng)用起到了抵消運(yùn)動誘發(fā)的血管生成的作用，所以可以認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)的MMP-2被PI3K/HIF-1α/VEGF信號途徑重新激活，可能是運(yùn)動引起的血管保護(hù)機(jī)制。

3 促進(jìn)MMP-2在血管新生過程作用的增強(qiáng)劑

NF-κB是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信息的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用，參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控，是細(xì)胞激活的標(biāo)志。NF-κB一般以同源或異源二聚體形式存在于靜息細(xì)胞中，與DNA模塊上的特異蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)特異mRNA的產(chǎn)生，而NF-κB信號通路的激活可調(diào)控miR-29的水平下降[14]。

微小RNA（miR）是一類存在于多種生物體中可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[15]。Jones等[16]研究25例胸主動脈瘤患者的miR-29的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)只有miR-29a表達(dá)下調(diào)，miR-29b和miR-29c表達(dá)均無變化。另一項研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞在生成血管過程中miR-29a確實(shí)起到了調(diào)節(jié)作用[17]。

Cai等[18]通過對CNV的研究表明，miR-29a表達(dá)的抑制反而刺激了內(nèi)皮細(xì)胞上MMP-2的水平增加，并發(fā)現(xiàn)在脈絡(luò)膜-RPE（視網(wǎng)膜色素上皮組織）中NF-κB的激活降低了miR-29的含量，進(jìn)而上調(diào)了MMP-2蛋白的水平，且形成一個NF-κB-miR-29-MMP-2環(huán)型電路，從而起到了促進(jìn)血管新生的作用。

4 MMP-2抑制血管新生

近年來以MMP為靶向目標(biāo)，抑制其酶活性的阻滯劑（MMPI）及其合成產(chǎn)物的相關(guān)研究逐步趨向成熟[19]。根據(jù)血管生成抑制劑作用靶點(diǎn)不同，將其分為以下8種：①直接作用于受體酪氨酸激酶（PTK）抑制劑；②直接作用于核酸（RNA）的抑制劑；③直接作用于VEGF的抑制劑；④作用于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；⑤直接作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制劑；⑥作用于整合素蛋白的拮抗劑；⑦非特異性血管生成抑制劑；⑧天然藥物及其成分中具有潛在抑制血管生成的物質(zhì)。

受制于內(nèi)源性組織抑制劑TIMP家族包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4 等[20]。其中TIMP-2為MMP-2的天然特異性組織抑制劑。有研究顯示，MMP-2一旦與細(xì)胞表面的受體分離，其活性可迅速被TIMP-2抑制。TIMP-2與活性狀態(tài)的MMP-2以1∶1分子比例非共價結(jié)合，這種結(jié)合是不可逆且穩(wěn)定的。其作用機(jī)制可能通過TIMP-2中17-19位點(diǎn)的亮氨酸-纈氨酸-異亮氨酸與MMP-2的 S1′S2′S3′區(qū)域結(jié)合，使 MMP-2 第 16 位上的天冬氨酸殘基的羧基和其活性中心的Zn2+結(jié)合，從而抑制其活性。MMP-2還能與MMP-2酶原結(jié)合而起抑制作用。

近年來也有一些關(guān)于外源性MMP-2抑制劑的研究報道。有研究表明，姜黃素通過下調(diào)MMP-2可以抑制人類乳腺癌細(xì)胞[21]、黑色素瘤B16F10細(xì)胞[22]的侵襲作用。劉立民等[23]研究還發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過抑制MMP-2活性及增強(qiáng)TIMP-2活性進(jìn)而降低前列腺癌PC-3M細(xì)胞的侵襲能力。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在人類肺腺癌細(xì)胞中還可以通過抑制JNK和P53磷酸化，減少NF-κB介導(dǎo)的蛋白表達(dá)和核內(nèi)活化蛋白-1的水平，導(dǎo)致MMP-2表達(dá)下調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。

ST104P （a tetrameric cyclic compound of 4，5 dihydroxynaphthalene-2，7-disulfonic acid linked by methylene bridges）是一個合成的聚酯硫酸化鉻酸鹽大環(huán)狀復(fù)合物，內(nèi)含4個單位萘。Ma等[25]通過明膠酶譜分析表明，ST104P以劑量相關(guān)依賴，并強(qiáng)有力地抑制內(nèi)皮細(xì)胞上MMP-2的活性；同時通過ELISA法和免疫印跡法分析表明，ST104P減弱了MMP-2的投放以顯露，最終減少了MMP-2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白水平。因此，ST104P是一個通過對MMP-2的下調(diào)節(jié)而起到有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-2的作用，進(jìn)而減弱了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管新生。然而這些說法仍有不足之處，目前不清楚還有哪些附加的通路參加并調(diào)節(jié)了抑制血管新生過程，仍待進(jìn)一步的研究。也有部分有關(guān)MMP-2抑制劑應(yīng)用于臨床的試驗(yàn)研究已完成，并得出了與上略有不同的結(jié)果[26]。

目前雖然發(fā)現(xiàn)部分藥物可以通過下調(diào)MMP-2而在一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，但僅限于實(shí)驗(yàn)研究或臨床試驗(yàn)過程，有待于更多MMP-2抑制劑的臨床應(yīng)用研究，去指導(dǎo)治療病態(tài)血管新生疾病研究。

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Role of the matrix metalloproteinase system in neovascularization

Matrix metalloproteinases-2；Angiogenesis；Extracellular matrix protein；Endothelial progenitor cell

2010-2013/2012-2015年度國家自然科學(xué)基金（項目編號：30960128/81260068）

133000 吉林省延邊市，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

趙光賢，E-mail：zhaoguangxian94@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．03．002

R54

A

1672-5301（2015）03-0198－04

2015-01-06）