老年心腦血管疾病亞甲基四氫葉酸還原酶基因型與葉酸代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

方愛仙 楊建蘭

老年心腦血管疾病亞甲基四氫葉酸還原酶基因型與葉酸代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

方愛仙 楊建蘭

目的 探討老年心腦血管疾病亞甲基四氫葉酸還原酶基因型與葉酸代謝相關(guān)血液指標(biāo)的相互關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP） 法檢測(cè)286例老年心腦血管疾病患者 MTHFR 基因中C677 T基因型。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定VB12、葉酸、HCY及其他部分生化指標(biāo)的血清濃度，血細(xì)胞分析儀測(cè)定血常規(guī)部分指標(biāo)。結(jié)果 老年心腦血管疾病患者中MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型CC型82例占28.7%，CT型118例占41.3%，TT型86例占20%；MTHFR 基因C677T 位點(diǎn)基因型TT 攜帶者血漿Hcy 水平顯著高于基因型CC及CT 攜帶者（P＜0.05），葉酸、VB12血清水平以TT最低（P＜0.05）。TT、CT、CC組的β-羥丁氨酸、肌酐、尿素氮、脂蛋白A值依次升高（P＜0.05）。結(jié)論 老年心腦血管疾病MTHFR基因型以CT型和TT型為主。TT型患者HCY水平最高，而葉酸和VB12水平最低。TT型可能是最易引起老年心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。

亞甲基四氫葉酸還原酶基因 心腦血管疾病 生化指標(biāo) 葉酸 HCY

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是催化同型半胱氨酸（HCY） 轉(zhuǎn)化成蛋氨酸的關(guān)鍵酶，高HCY血癥與心腦血管梗死的關(guān)系日益受到人們關(guān)注。MTHFR 基因缺陷是致動(dòng)脈性疾病和靜脈栓塞的危險(xiǎn)因素［1］。TT外顯子677位點(diǎn)上存在等位基因C和T多態(tài)現(xiàn)象。通常等位基因C為野生型，T為突變型。C與T對(duì)應(yīng)氨基酸殘基分別為丙氨酸和纈氨酸。纈氨酸取代丙氨酸后使MTHFR穩(wěn)定性和活性下降，引起機(jī)體Hcy蓄積，導(dǎo)致高Hcy血癥，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成［2］。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年10月至2014年9月本院住院的286例老年心腦血管疾病患者（其中腦動(dòng)脈粥樣硬化18例，腦動(dòng)脈供血不足15例，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化型心臟病42例，冠心病心律失常14例，高血壓病207例）。其中男167例，女119例；年齡78～91歲，平均85.3歲。

1.2 試劑 Tris-HCl 飽和酚購(gòu)于北京邦定公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP mix 為Gibco BRL 公司產(chǎn)品；Hinf ?、Hae ó限制性內(nèi)切酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)PUC19DNA/ MSP?為MBI公司產(chǎn)品；丙烯酰胺購(gòu)自Promega公司；甲叉雙丙烯酰胺、TEMED購(gòu)于上海生物工程公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；Big-Dye 測(cè)序試劑盒為Perkin Elmer 公司產(chǎn)品。同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒（酶比色法）購(gòu)自重慶中元生物技術(shù)有限公司。葉酸檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自羅氏診斷試劑公司。維生素B12（VB12）檢測(cè)試劑盒（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法）購(gòu)自北京泰格科信生物科技有限公司。

1.3 操作方法 （1）清晨空腹取靜脈血8ml，2%EDTA抗凝，1h內(nèi)將標(biāo)本離心（4e，3000r/min，5min），取血漿置- 20℃保存?zhèn)錂z。（2） 鹽酸胍法提取DNA，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）法檢測(cè)MTHFR 基因C677T基因型。C677T引物S 5c-TGAAGGA GAAGGTGTCTGCGGA-3c 和AS5c-AGGACGGT GCGGTGAAGTG-3c。（3） 50μl PCR反應(yīng)體系含引物S 和AS 各200nmol/L、200nmol/L dNTPs 5μl、10× Buf fer 5μl、DNA 模板3μl、10%二甲基亞砜5μl、Taq DNA聚合酶2U，加雙蒸水至50μl，混勻加石蠟油封閉。（4） PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，隨后按94℃ 55s、55℃ 55s、72℃ 60s 進(jìn)行熱循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。（5） 取擴(kuò)增產(chǎn)物25μl，加Hinf I內(nèi)切酶10U混勻，37℃過(guò)夜，消化產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，溴乙啶染色后分析MTHFR基因型。（6）統(tǒng)計(jì)處理頻率分布。（7） HCY采用OLYMPUS AU5400生化儀測(cè)定。（8）葉酸和VB12采用美國(guó)雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定。（9）采用OLYMPUS AU5400生化儀測(cè)定部分生化指標(biāo)。（10）采用sysmex血常規(guī)分析儀測(cè)定紅細(xì)胞和血小板的部分參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因型分布和葉酸、VB12、HCY結(jié)果比較 286例患者中CC型82例占28.7%，CT型118例占41.3%，TT型86例占20%。等位基因C占49.3%，T基因占50.7%。TT型HCY水平明顯高于CC和CT組（P＜0.01），VB12和葉酸明顯低于CC和CT組（P＜0.05）。說(shuō)明基因型TT是血漿HCY水平升高的危險(xiǎn)因素。

2.2 不同MTHFR基因型部分生化指標(biāo)結(jié)果比較 MTHFR的CC、CT、TT三型的空腹血糖、β-羥丁氨酸、肌酐、甘油三酯、低密度脂蛋白、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、平均血紅蛋白含量（MCH）、血小板總數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、大血小板比例均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TT組的空腹血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白水平、大血小板比例明顯高于CC和CT組（P＜0.05），說(shuō)明TT基因型是糖尿病、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓發(fā)生的高危因素。

3 討論

HCY 是蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基后生成的中間代謝產(chǎn)物，HCY 在葉酸、維生素B12參與下，經(jīng)MTHFR及蛋氨酸合成酶催化接受甲基重新合成蛋氨酸。如果葉酸、維生素B12缺乏，HCY 代謝相關(guān)酶MTHFR、胱硫醚B合成酶基因突變使酶缺乏和活性降低，均可使HCY再甲基化障礙，引起血漿HCY水平升高。HCY可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)血栓形成，高HCY 血癥是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］。其機(jī)制可能與其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用以及增加血液中血小板的粘附性均有關(guān)［4～6］。

MTHFR基因第4外顯子的一個(gè)較為常見的錯(cuò)義突變C677T，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）可以獲得該基因677位點(diǎn)的基因片段，全長(zhǎng)198bp，如果存在突變，則可產(chǎn)生Hinf I限制酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)Hinf I內(nèi)切酶作用后可切出175bp和23bp兩個(gè)片段。突變后產(chǎn)生3三種基因型： 野生純合型C /C（198bp）、雜合型C/T（198/175bp） 及突變純合型T /T （175bp）［3］。C677T堿基突變可使MTHFR的熱敏感性改變而致酶活性改變。TT基因型的MTHFR 酶活性最低，CT型的酶活性中等，CC型的酶活性最高，酶活性的下降可使Hcy 的水平不同程度的升高。本資料進(jìn)一步證實(shí)了基因型TT攜帶者血漿HCY水平最高，CT次之，CC最低，基因型TT和CT及CC型血漿HCY比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CC、CT、TT組血清葉酸水平依次降低，以TT組最低，CC組最高，說(shuō)明CC組MTHFR的酶活性最高。除此之外，MTHFR的基因多態(tài)性對(duì)空腹血糖、β羥丁氨酸、肌酐、甘油三酯、低密度脂蛋白、脂蛋白A等生化指標(biāo)和MCV、MCHC、MCH等血常規(guī)指標(biāo)以及PLT、MPV、大血小板比例等血小板部分參數(shù)亦存在一定影響，CC、CT、TT三組之間亦有明顯差異。CT組的PLT數(shù)量明顯大于CC和TT組的（P＜0.05）。CC組的MPV大于CT和TT組（P＜0.01）。TT組大血小板比例大于CC和CT組（P＜0.01）。說(shuō)明TT基因型是引起血栓的危險(xiǎn)因素。TT組的空腹血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白水平、大血小板比例明顯高于CC和CT組（P＜0.05），說(shuō)明TT基因型與糖尿病，高血脂，動(dòng)脈粥樣硬化，血栓發(fā)生存在一定的相關(guān)性。

1 Sahu JK,Sriwastva M,Prakash K． An association between methylenetetrahydrofolate reductase (C677T) polymorphism and largeartery ischemic stroke． Acta Neurol Scand,2012,125(1):26～30．

2 Malinowska A,Chmurzynska A． Polymorphism of genes encoding homocysteine metabolism -related enzymes and risk for cardiovascular disease． Nutr Res,2009,29(10):685～695．

3 宋寧,徐秀英．MTHFR基因的多態(tài)性及高同型半胱氨酸血癥與心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)系．心臟雜志, 2005,26(1):41～43．

4 Bailey LB, Gregory JF． Polymorphisms of methylenetetr ahydrofolate reductase and other enzymes: metabolic significance, risks and impact on folate requirement．J Nutr,1999,129(5):919～922．

5 張銘,陳懷生,楊大春,等．同型半胱氨酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷及對(duì)IL-8 分泌的影響．心臟雜志,2005,17(5):450～452．

6 蔣暉,李錦,毛建斌,等．同型半胱氨酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)皮CD40表達(dá)的影響．心臟雜志,2004,16(5):431～434．

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