外源激素ABA影響新疆荒漠鹽生植物異子蓬異型種子萌發(fā)機(jī)制

曹 婧, 李曉榮, 王 翠, 王 璐, 蘭欣欣, 蘭海燕

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830046

外源激素ABA影響新疆荒漠鹽生植物異子蓬異型種子萌發(fā)機(jī)制

曹 婧, 李曉榮, 王 翠, 王 璐, 蘭欣欣, 蘭海燕*

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830046

以新疆荒漠鹽生植物異子蓬(Suaedaaralocaspica)異型種子為材料，通過(guò)外源ABA直播(長(zhǎng)時(shí)間)與浸種(短時(shí)間)處理分別研究不同濃度(0、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L)ABA對(duì)異型種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)定量PCR技術(shù)分析與萌發(fā)相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因和DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因在5.0 μmol/L ABA處理下的表達(dá)規(guī)律，探討外源ABA影響異子蓬異型種子萌發(fā)差異的機(jī)制。結(jié)果顯示：(1)外源ABA直播處理下，褐色種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)均受到明顯抑制，黑色種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)在低濃度被促進(jìn)，較高濃度被顯著抑制；短時(shí)間浸種處理，能夠同時(shí)促進(jìn)異型種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，且隨ABA濃度增加促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)。(2)直播萌發(fā)后，褐色種子中3個(gè)基因的表達(dá)量與對(duì)照相比均不變或降低表達(dá)(除了DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因在8 h顯著升高)，黑色種子與對(duì)照相比均上調(diào)表達(dá)(除了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在8h顯著下調(diào))；短時(shí)間浸種萌發(fā)后，褐色種子中3個(gè)基因的表達(dá)量均比對(duì)照顯著升高，黑色種子中升高不明顯。基因表達(dá)規(guī)律與種子萌發(fā)結(jié)果趨勢(shì)一致，暗示ABA浸種可能觸發(fā)了異子蓬種子萌發(fā)內(nèi)在機(jī)制并對(duì)隨后的萌發(fā)過(guò)程產(chǎn)生促進(jìn)作用。而黑色種子對(duì)ABA處理表現(xiàn)出較好的萌發(fā)響應(yīng)，可能是其幼苗能抵御荒漠地區(qū)逆境環(huán)境的重要原因。

ABA; 異子蓬; 異型種子; 種子萌發(fā); 定量PCR; 分子機(jī)制

種子休眠和萌發(fā)是高等植物個(gè)體發(fā)育中的重要事件，直接關(guān)系到種群的生存、分布和繁衍，具有重要的生態(tài)意義[1]。種子萌發(fā)是極其復(fù)雜的生理過(guò)程，受到環(huán)境因素、內(nèi)部因素及萌發(fā)相關(guān)基因的調(diào)控。迄今對(duì)大量影響種子休眠和萌發(fā)突變體的研究發(fā)現(xiàn)，在種子休眠的獲得或解除過(guò)程中起關(guān)鍵作用的內(nèi)源信號(hào)分子是脫落酸(Abscisic acid, ABA)和赤霉素(Gibberellin 3, GA3)[2]，其中，脫落酸對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多重要過(guò)程都起調(diào)節(jié)作用，包括種子貯藏蛋白和脂質(zhì)的合成、種子的耐脫水性和休眠、胚胎生長(zhǎng)向萌發(fā)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的抑制和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的抑制等[3-4]，特別是對(duì)保持種子休眠和抑制種子萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗生長(zhǎng)等具有重要作用[5-6]。研究表明，ABA的營(yíng)養(yǎng)缺陷型能夠增強(qiáng)種子萌發(fā)能力，甚至有時(shí)會(huì)產(chǎn)生胎萌[7]，而大量積累ABA的轉(zhuǎn)基因株系增強(qiáng)了休眠，且ABA能抑制這些轉(zhuǎn)基因株系后代種子的早熟發(fā)芽，誘導(dǎo)種子的初級(jí)休眠[8-9]。深入研究顯示，ABA主要通過(guò)抑制細(xì)胞壁降解酶的合成使種子的胚乳不能軟化，導(dǎo)致胚根尖無(wú)法突破種皮而抑制萌發(fā)[10]。多項(xiàng)研究表明，添加外源ABA能夠抑制多種植物種子的萌發(fā)[11-15]，但也有報(bào)道顯示低濃度的外源ABA能夠促進(jìn)某些植物如黃連種子的萌發(fā)[16]，也可促進(jìn)植物根或胚軸的生長(zhǎng)等[17-18]。但有關(guān)外源ABA 促進(jìn)植物種子特別是荒漠鹽生植物種子萌發(fā)的相關(guān)機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。

異子蓬(Suaedaaralocaspica)是藜科異子蓬屬具典型種子異型性的一年生草本鹽生植物，在我國(guó)僅分布于準(zhǔn)噶爾盆地南緣，生長(zhǎng)于重度鹽堿化荒漠戈壁和丘間低地，其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等各個(gè)階段都受到逆境的脅迫，具有很強(qiáng)的耐干旱、鹽堿和貧瘠能力[19-20]。種子異型性在鹽生植物中較常見(jiàn)，是鹽生植物應(yīng)對(duì)脅迫生境的重要策略之一[21]。異子蓬異型種子的種皮結(jié)構(gòu)存在顯著差異，褐色種子只有一層薄膜狀種皮，而黑色種子有內(nèi)外兩層種皮結(jié)構(gòu)且外種皮細(xì)胞排列致密，質(zhì)地堅(jiān)硬[22]。黑色種子的外種皮限制了胚胎吸水速度，對(duì)胚根伸長(zhǎng)產(chǎn)生一定的機(jī)械阻力，從而導(dǎo)致與褐色種子之間具有不同的萌發(fā)與休眠特性，對(duì)環(huán)境刺激也產(chǎn)生不同的響應(yīng)[23]。在本研究小組前期對(duì)異子蓬種子萌發(fā)的脅迫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度ABA處理能夠明顯促進(jìn)異子蓬異型種子的萌發(fā)，且有時(shí)間效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。同時(shí)利用cDNA-AFLP技術(shù)研究了異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)的差異，從中篩選到一些在種子萌發(fā)過(guò)程顯著上調(diào)的基因，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因和DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因等，并在此基礎(chǔ)上選擇了以上基因?qū)BA影響異子蓬異型種子萌發(fā)的深層機(jī)制進(jìn)行分析。目前，對(duì)異子蓬的研究主要集中于葉片解剖結(jié)構(gòu)[23-25]、光合類(lèi)型[26]及異型種子萌發(fā)特性[27]等方面，對(duì)脅迫(包括ABA處理)下異型種子萌發(fā)差異的深層機(jī)制的探索研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；谇捌诘某醪綄?shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步了解ABA促進(jìn)異子蓬異型種子萌發(fā)的分子機(jī)制，本研究以ABA直播(長(zhǎng)時(shí)間)和浸種(短時(shí)間)處理方式和不同濃度對(duì)異型種子的萌發(fā)過(guò)程和特性、幼苗生長(zhǎng)以及萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)等方面進(jìn)行了分析，期望從分子水平對(duì)ABA促進(jìn)異子蓬種子萌發(fā)的機(jī)制有深入理解，并探索ABA在鹽生植物異型種子休眠與萌發(fā)中的調(diào)控方式，為今后利用干旱區(qū)植物資源修復(fù)并改良鹽堿地生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2011年10月于新疆五家渠103團(tuán)治沙站北沙窩(44°29′N(xiāo), 87°31′E)重度鹽堿地上自然成熟的異子蓬植株上采集兩種類(lèi)型種子。此生境屬于中溫帶荒漠區(qū)，春季有融雪、較濕潤(rùn)；全年降雨稀少(僅310 mm)，蒸發(fā)量大(約1300 mm)，大氣濕度和土壤含水量均很低。種子采集后，置通風(fēng)避光處晾干，篩選干凈，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

萌發(fā)實(shí)驗(yàn)均按4重復(fù)、每重復(fù)30粒種子設(shè)置。① 直播處理：將完整飽滿(mǎn)大小一致的異子蓬異型種子，隨機(jī)播在鋪有二層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，分別添加5 mL不同濃度(0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L)ABA溶液和蒸餾水，于25 ℃、16 h光 /8 h 暗的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，期間不斷補(bǔ)充水分及對(duì)應(yīng)濃度的ABA溶液。② 浸種處理：分別用上述濃度ABA溶液浸泡種子3 h，以蒸餾水洗凈種子后，接入用蒸餾水浸潤(rùn)飽和的濾紙上進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。種子萌發(fā)以胚根露出為準(zhǔn)，每24 h記錄一次，直到發(fā)芽率恒定后統(tǒng)計(jì)終萌發(fā)率，同時(shí)選擇30株幼苗分別測(cè)量子葉、下胚軸及胚根長(zhǎng)度。

1.2.2 萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)分析

(1) 直播處理 挑選40粒完整飽滿(mǎn)的異子蓬異型種子置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加5 mL 5.0 μmol/L ABA(預(yù)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)萌發(fā)的濃度)和滅菌蒸餾水于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。萌發(fā)8 h和3 d時(shí)分別選擇狀態(tài)一致的種子(幼苗)提取總RNA(參照Bioteke RNAprep Pure Plant Kit試劑盒說(shuō)明書(shū))。

(2) 浸種處理 分別添加5.0 μmol/L ABA和滅菌蒸餾水浸泡異子蓬異型種子3 h后，用蒸餾水洗凈種皮表面殘留溶液后于水中萌發(fā)，選擇萌發(fā)8 h和萌發(fā)3 d時(shí)狀態(tài)一致的種子(幼苗)提取總RNA。

利用GeneAmp 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)及SYBR Green (Invitrogen)進(jìn)行定量PCR分析。反應(yīng)條件:95℃ 2 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物見(jiàn)表1。以異子蓬β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，分析ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ABC transporter family protein，簡(jiǎn)稱(chēng)SaABC)、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(Mitogen-activated protein kinase kinase，簡(jiǎn)稱(chēng)SaMAPKK)以及DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因(DNA repair and transcription factor，簡(jiǎn)稱(chēng)SaDRTF)在上述不同脅迫處理及不同萌發(fā)時(shí)間的表達(dá)變化，具體操作步驟參照Invitrogen公司熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)。

表1 定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換，以保證方差齊性。本研究中萌發(fā)數(shù)據(jù)采用4次重復(fù)，熒光定量數(shù)據(jù)采用3次生物學(xué)重復(fù)和兩次技術(shù)重復(fù)(共6個(gè)重復(fù))計(jì)算平均值，所有圖表中的誤差線(xiàn)代表平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。數(shù)據(jù)分析和圖的繪制均用GraphPad Prism 4軟件。利用One-way ANOVA和Two-way ANOVA對(duì)種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)及基因表達(dá)規(guī)律等進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。用Tukey多重比較法確定各樣本間的差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素ABA對(duì)異子蓬異型種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

異子蓬褐色與黑色種子在ABA不同處理下的萌發(fā)進(jìn)程存在較大差異，日累計(jì)萌發(fā)率及終萌發(fā)率結(jié)果(圖1,圖2)。隨ABA濃度的增加，直播的褐色種子萌發(fā)率逐漸降低且均低于對(duì)照，而所有浸種處理的褐色種子萌發(fā)率均高于對(duì)照；黑色種子萌發(fā)則在ABA較低濃度(0.5、1.0 μmol/L)的直播及較高濃度的浸種(1.0、5.0、10.0 μmol/L)均受到促進(jìn)。

雙因素方差分析結(jié)果顯示(表2)，ABA直播與浸種兩種處理下，種子類(lèi)型、ABA濃度以及二者間的交互作用均對(duì)異子蓬種子萌發(fā)具有顯著影響。

圖1 不同脫落酸(ABA)濃度對(duì)異子蓬異型種子萌發(fā)進(jìn)程的影響Fig.1 Effect of various concentration of abscisic acid on germination process of S. aralocaspica heteromorphic seed

圖2 不同ABA濃度對(duì)異子蓬異型種子終萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of various concentration of ABA on final germination percentage of S. aralocaspica heteromorphic seed

表2 不同濃度脫落酸(ABA)和種子類(lèi)型對(duì)異子蓬種子萌發(fā)影響的雙因素方差分析

不同濃度ABA處理的異子蓬異型種子幼苗生長(zhǎng)情況存在較大差異(圖3,兩周幼苗)，從幼苗長(zhǎng)勢(shì)觀(guān)察，隨ABA濃度升高，直播的褐色和黑色種子幼苗生長(zhǎng)受到較明顯抑制，且程度依次加??；而浸種處理對(duì)幼苗無(wú)明顯抑制現(xiàn)象，且低濃度(0.5μmol/L與1.0μmol/L)ABA對(duì)幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生一定促進(jìn)作用。

圖3 不同ABA濃度對(duì)異子蓬異型種子幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of various concentration of ABA on seedling growth of S. aralocaspica heteromorphic seed

對(duì)幼苗子葉、下胚軸和胚根長(zhǎng)度的測(cè)量結(jié)果顯示：直播處理下(表3)，褐色種子幼苗的子葉、下胚軸及胚根生長(zhǎng)均受ABA的不顯著抑制，10.0 μmol/L則顯著影響其下胚軸和胚根的伸長(zhǎng)(P<0.0001)；低濃度ABA(0.5—1.0 μmol/L)不顯著地促進(jìn)黑色種子幼苗子葉和下胚軸生長(zhǎng)，但所有處理濃度均抑制其胚根伸長(zhǎng)，特別是高濃度下抑制作用更明顯。浸種處理對(duì)兩種幼苗的子葉和下胚軸生長(zhǎng)均表現(xiàn)促進(jìn)作用(表4)，但對(duì)胚根伸長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。整體趨勢(shì)顯示，ABA浸種處理的幼苗子葉和下胚軸長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于直播處理。

ABA與種子類(lèi)型對(duì)異子蓬幼苗生長(zhǎng)影響的雙因素方差分析結(jié)果顯示，直播處理下(表5)，不同ABA濃度對(duì)異子蓬幼苗子葉、下胚軸、胚根的伸長(zhǎng)均有顯著影響，種子類(lèi)型僅對(duì)幼苗下胚軸伸長(zhǎng)有顯著影響，二者之間的交互作用對(duì)幼苗各項(xiàng)指標(biāo)的影響均不顯著；浸種處理下(表6)，不同ABA濃度對(duì)異子蓬幼苗子葉、胚根伸長(zhǎng)具有顯著影響，種子類(lèi)型僅對(duì)幼苗子葉伸長(zhǎng)有顯著影響，而二者交互作用對(duì)子葉、胚根伸長(zhǎng)具有顯著影響。

2.2 外源激素ABA處理下異子蓬種子萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解添加外源ABA促進(jìn)異子蓬異型種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的內(nèi)在機(jī)制，基于前期對(duì)異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程中mRNA (cDNA)的差異表達(dá)分析結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，選擇了其中可能與種子萌發(fā)相關(guān)的3個(gè)基因，包括:ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SaABC)、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(SaMAPKK)、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因(SaDRTF)，對(duì)5.0 μmol/L ABA直播或浸種后萌發(fā)0 h(對(duì)照)、8 h(萌發(fā)期)和3 d(幼苗早期)的表達(dá)情況進(jìn)行了定量PCR分析。

2.2.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SaABC)

如圖4所示，在5.0 μmol/L ABA直播處理下異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)與對(duì)照相比顯著降低(褐色種子在處理3 d時(shí)，黑色種子在處理8 h時(shí))。浸種處理時(shí)褐色和黑色種子中該基因在8 h和3 d時(shí)均比水中萌發(fā)的表達(dá)升高，褐色種子中表現(xiàn)為極顯著上調(diào)(P<0.001)。

圖4 定量PCR檢測(cè)ABA處理下ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SaABC)的表達(dá)規(guī)律Fig.4 Quantitative PCR analysis of the expression pattern of SaABC gene in S. aralocaspica under H2O and ABA treatment

2.2.2 絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(SaMAPKK)

異子蓬褐色種子在水中萌發(fā)時(shí)絲裂原活化蛋白激酶激酶基因的表達(dá)呈現(xiàn)8 h顯著升高(P<0.05)，3 d下降趨勢(shì)(圖5)。5.0 μmol/L ABA直播或浸種處理后褐色種子中該基因的表達(dá)變化趨勢(shì)與對(duì)照一致，但浸種處理該基因在8 h和3 d時(shí)相對(duì)于水中的萌發(fā)表達(dá)極顯著上升(P<0.001)。黑色種子中，該基因在水中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化不顯著，而ABA直播或浸種兩種處理下該基因的表達(dá)隨時(shí)間有增高趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。

圖5 定量PCR檢測(cè)ABA處理下絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(SaMAPKK)的表達(dá)規(guī)律Fig.5 Quantitative PCR analysis of the expression pattern of SaMAPKK gene in S. aralocaspica under H2O and ABA treatment

2.2.3 DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因(SaDRTF)

5.0 μmol/L ABA直播或浸種處理褐色和黑色種子萌發(fā)過(guò)程中DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因在8 h時(shí)的表達(dá)均比水中顯著升高(圖6)，3 d時(shí)直播黑色種子和浸種褐色種子該基因的表達(dá)比水中顯著上升，直播褐色種子和浸種黑色種子表達(dá)與對(duì)照無(wú)顯著差異。

圖6 定量PCR檢測(cè)ABA處理下DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因(SaDRTF)的表達(dá)規(guī)律Fig.6 Quantitative PCR analysis of the expression pattern of SaDRTF gene in S. aralocaspica under H2O and ABA treatment

3 討論

ABA 是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種倍半萜類(lèi)化合物，作為最重要的激素之一參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育(如胚胎發(fā)育、種子休眠與萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、根系發(fā)育、果實(shí)成熟和衰老等)，并對(duì)干旱、高鹽、低溫、病菌等脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[3-4, 28-30]。通常認(rèn)為ABA是促進(jìn)種子成熟、誘導(dǎo)和維持種子休眠并抑制種子萌發(fā)的植物激素[31-35]。但對(duì)某些植物而言，低劑量的ABA卻能促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[16,36-41]。然而目前對(duì)ABA促進(jìn)種子萌發(fā)的深層機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)ABA對(duì)異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程的影響及相關(guān)基因的表達(dá)分析，初步探討了ABA促進(jìn)種子萌發(fā)的機(jī)制。對(duì)異子蓬褐、黑種子進(jìn)行ABA直播和短時(shí)間浸種萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度ABA可能通過(guò)引發(fā)(或觸發(fā))萌發(fā)過(guò)程相關(guān)生理機(jī)制及分子事件從而促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。

研究表明，外源ABA能促進(jìn)黃連種子萌發(fā)[16]；低濃度(≤1 μmol/L) ABA可以刺激擬南芥、豌豆(Pisumsativum)及黃豆幼苗根部的生長(zhǎng)[17, 36]；此外，ABA還能促進(jìn)擬南芥根毛的發(fā)生[37]；Xing等發(fā)現(xiàn) 0.5 μmol/L ABA能刺激擬南芥幼苗根伸長(zhǎng)，但高濃度(5—50 μmol/L) ABA處理后，根長(zhǎng)及生物量積累均受到抑制[38]，由此說(shuō)明ABA對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響存在劑量效應(yīng)。ABA浸種能顯著促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，如ABA浸種處理水稻后的秧苗素質(zhì)、壯苗指標(biāo)及產(chǎn)量均明顯優(yōu)于對(duì)照組[39-40]；經(jīng)過(guò)較高濃度ABA浸種的甜瓜種子能夠明顯促進(jìn)幼苗后期生長(zhǎng)[41]。本研究通過(guò)對(duì)新疆荒漠鹽生植物異子蓬異型種子在低濃度ABA直播或浸種處理下的萌發(fā)過(guò)程觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，褐色與黑色種子在ABA不同處理下的萌發(fā)進(jìn)程存在明顯差異。不同濃度外源ABA直播處理下異子蓬褐色種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)均受到明顯抑制，并呈劑量效應(yīng)；直播黑色種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)在低濃度(0.5—1.0 μmol/L)ABA被促進(jìn)，較高濃度則被顯著抑制；而ABA短時(shí)間浸種處理能夠同時(shí)促進(jìn)褐色和黑色種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)，且隨ABA的濃度增加促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是異型種子種皮結(jié)構(gòu)的差異以及低濃度ABA短時(shí)間處理起到的刺激信號(hào)作用。通常成熟種子的種皮主要用以保護(hù)胚胎免受外界環(huán)境不利條件的影響[42]。而異子蓬褐色種子只有一層薄膜狀種皮[22]，透水性強(qiáng)，無(wú)休眠現(xiàn)象，胚根極易突破種皮，遇水就能萌發(fā)(直播0—8 h內(nèi)萌發(fā)率接近60%)。當(dāng)種子長(zhǎng)時(shí)間在ABA溶液中直接萌發(fā)時(shí)，由于胚幾乎沒(méi)有任何保護(hù)層，即使ABA濃度很低，仍然對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用；而黑色種子具有一層致密且堅(jiān)硬的外種皮[22]，透水性差、阻礙外界空氣進(jìn)入及內(nèi)外物質(zhì)交換[43]，處于非深度休眠狀態(tài)，雖然直播處理后種皮軟化，吸水增強(qiáng)，但黑色種子致密的外種皮仍能對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的ABA直接處理產(chǎn)生一定隔離保護(hù)作用，使較高濃度ABA對(duì)黑色種子萌發(fā)沒(méi)有影響(盡管幼苗生長(zhǎng)受到抑制)，而此時(shí)低濃度ABA作為長(zhǎng)時(shí)間的刺激(或適當(dāng)脅迫)因素，在一定程度上激活了種子內(nèi)在的生理活性，緩解了黑色種子的休眠狀態(tài)，從而提高種子的萌發(fā)率。在短時(shí)間浸種(用ABA浸泡種子3 h后于水中萌發(fā))處理下，較高濃度的ABA在一定程度上得以稀釋從而產(chǎn)生了低劑量效應(yīng)，更重要的是，前期較高濃度ABA的短時(shí)間浸種對(duì)褐色及黑色種子的萌發(fā)起到了一定的引發(fā)刺激作用，并能緩解黑色種子的休眠，這種脈沖刺激和低劑量效應(yīng)同時(shí)作用，顯著地促進(jìn)了兩種種子的萌發(fā)及隨后的幼苗生長(zhǎng)。這也同時(shí)能夠說(shuō)明ABA低濃度直播而高濃度浸種促進(jìn)黑色種子萌發(fā)的現(xiàn)象。研究顯示，異子蓬黑色種子萌發(fā)需經(jīng)過(guò)極端逆境的引發(fā)效應(yīng)，從而打破休眠[44]。本研究采用了不同濃度ABA直播和浸種兩種方式，分別代表著不同劑量長(zhǎng)時(shí)間和短時(shí)間的處理，結(jié)果顯示，ABA對(duì)異子蓬種子特別是黑色種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不僅有劑量效應(yīng)(低濃度和高濃度)，還有時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)(長(zhǎng)時(shí)間直播和短時(shí)間浸種)。ABA對(duì)異子蓬種子的這種短時(shí)間促進(jìn)而長(zhǎng)時(shí)間抑制的作用方式暗示，外源ABA短暫處理可能對(duì)種子萌發(fā)起到了“引發(fā)”(或“觸發(fā)”)的作用，類(lèi)似于引發(fā)劑在種子萌發(fā)中的促進(jìn)作用[45-46]；ABA亦或作為一種脅迫因素促進(jìn)了種子萌發(fā)過(guò)程中防御系統(tǒng)的啟動(dòng)，從而使與萌發(fā)相關(guān)的生理過(guò)程和分子事件變得活躍。ABA促進(jìn)種子休眠以及抑制種子萌發(fā)的機(jī)制已眾所周知[5-6]，但在一定條件下，當(dāng)ABA做為第二信使起作用時(shí)[47]，它能夠通過(guò)刺激相應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)，激發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)及適應(yīng)機(jī)制的啟動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)植物的適應(yīng)反應(yīng)[48-49]。如Xiong等從水稻中分離得OsMAPK5基因，可被外源ABA激活，正調(diào)控與干旱、高鹽和低溫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[50]；添加外源ABA能使高粱中甜菜堿醛脫氫酶BADH的表達(dá)水平上升，添加ABA合成抑制劑則會(huì)使該基因下調(diào)表達(dá)，ABA通過(guò)促進(jìn)BADH和甜菜堿的合成來(lái)調(diào)節(jié)水分和離子平衡，從而增加耐鹽性[51]；外源ABA能使抗寒基因cor基因家族(cor78、cor47、cor15a、cor66等)上調(diào)表達(dá)，參與調(diào)控?cái)M南芥冷誘導(dǎo)基因cor15和rd19a的啟動(dòng)等，最終提高植物耐寒性[52]。浸種處理可以提前完成種子萌發(fā)過(guò)程的代謝活動(dòng)，提高種子的萌發(fā)率，促進(jìn)極端環(huán)境下幼苗的最初生長(zhǎng)并提高植物抗逆性[53]。研究表明，ABA處理可顯著提高澇漬條件下水稻種子的出苗率、種子相對(duì)活力指數(shù)[54]；ABA預(yù)浸種能緩解鹽脅迫對(duì)向日葵種子的傷害[55]；低濃度ABA處理能緩解鎘對(duì)種子萌發(fā)的毒害作用等[56]。

ABA對(duì)異子蓬種子萌發(fā)引發(fā)作用的推測(cè)與對(duì)萌發(fā)相關(guān)基因表達(dá)的分析結(jié)果相吻合。為了探索ABA對(duì)異子蓬種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用的內(nèi)在機(jī)制，利用前期在異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程中獲得的mRNA(cDNA-AFLP)差異條帶，從中選取了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SaABC)、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因(SaMAPKK)、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因(SaDRTF)等在異型種子中顯著上調(diào)表達(dá)的基因開(kāi)展研究。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較高濃度ABA長(zhǎng)時(shí)間處理黑色種子時(shí)，盡管沒(méi)有影響其萌發(fā)率(還有少許升高)，但其幼苗生長(zhǎng)受到了顯著影響，這似乎暗示較高濃度ABA長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)幼苗的生長(zhǎng)影響更嚴(yán)重，為了區(qū)分萌發(fā)期和幼苗期對(duì)ABA響應(yīng)可能存在的內(nèi)部差異，選擇了萌發(fā)8 h代表萌發(fā)期(前期研究確定此時(shí)間點(diǎn)足以看出異型種子相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)趨勢(shì))，3 d代表幼苗期對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，這3個(gè)基因在5.0 μmol/L ABA短時(shí)間浸種的異子蓬萌發(fā)種子及幼苗中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)(褐色種子達(dá)顯著水平)，而在直播處理中則較大程度上表現(xiàn)不變或降低表達(dá)。以上趨勢(shì)初步顯示，在短暫浸種處理時(shí)，ABA可能作為信號(hào)分子激發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)從而促進(jìn)萌發(fā)過(guò)程[47-49]。經(jīng)ABA直播3 d的褐色種子幼苗中各基因的表達(dá)比對(duì)照降低或不變，而黑色種子幼苗中有兩個(gè)基因的表達(dá)與對(duì)照無(wú)差異。這與萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中的觀(guān)察結(jié)果基本一致，即一定濃度ABA長(zhǎng)期處理對(duì)異子蓬幼苗生長(zhǎng)的影響比萌發(fā)更強(qiáng)烈。研究表明，擬南芥中AtPMP2蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的ABCD亞族，其功能是運(yùn)載長(zhǎng)鏈脂肪酸到過(guò)氧化物酶體，是脂肪酸β氧化所必需的蛋白，種子中該基因的突變將導(dǎo)致萌發(fā)缺陷[57]。Footitt等在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以控制擬南芥的種子萌發(fā)和休眠，并且轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸乙酰輔酶A進(jìn)入過(guò)氧化物酶體[58]。在此之前Russell等也曾報(bào)道ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可以顯著促進(jìn)種子萌發(fā)，該基因的突變體表現(xiàn)為深度休眠[59]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)極其復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路，植物遭受低溫、干旱、機(jī)械損傷、植物激素、活性氧物質(zhì)及病原體侵染等脅迫時(shí)會(huì)激活MAPK，它是植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境的重要組分[60-62]。絲裂原活化蛋白激酶激酶基因作為MAPK信號(hào)通路中第2個(gè)關(guān)鍵蛋白，受多種信號(hào)分子的調(diào)控，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAPK級(jí)聯(lián)途徑參與調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[63]。在非生物脅迫下植物細(xì)胞DNA 可能受到嚴(yán)重?fù)p傷，并由此對(duì)植物產(chǎn)生毒性[64]。為此，DNA修復(fù)相關(guān)因子在其中起到重要作用。有報(bào)道顯示，擬南芥種子在吸脹過(guò)程中 DNA 連接酶迅速表達(dá)，且在沒(méi)有 DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂的情況下，有大量新DNA的合成，說(shuō)明是對(duì)損傷的 DNA進(jìn)行修復(fù)[65]。本研究中外源ABA浸種處理下異子蓬異型種子萌發(fā)過(guò)程中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、絲裂原活化蛋白激酶激酶基因和DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子基因盡管在8 h和3 d時(shí)的表達(dá)量比對(duì)照的萌發(fā)均顯著上升，但3個(gè)基因的總體表達(dá)趨勢(shì)是下降的(圖4，圖5，圖6)，這可能由于前3h種子完全浸沒(méi)在水中，從而對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，因?yàn)楹稚N子用蒸餾水浸種處理的萌發(fā)率比直播的明顯降低(圖1，圖2)。

生存于鹽堿地中的植物通常都面臨一系列的逆境脅迫，而鹽生植物種子應(yīng)對(duì)逆境脅迫主要有兩種策略：一是直接在高鹽、干旱等條件下順利萌發(fā)；其次在逆境中不萌發(fā)但保持生活力，待環(huán)境條件適合時(shí)迅速萌發(fā)[66]。而異子蓬作為典型的荒漠鹽生植物，同時(shí)具有這兩種特性，即褐色種子種皮薄萌發(fā)快、耐受逆境能力較強(qiáng)，黑色種子種皮厚且硬、能抵御外界不良因素刺激、可在逆境中保持休眠推遲萌發(fā)[22, 67]。ABA是種子成熟過(guò)程中積累的主要激素，也可以作為一種脅迫刺激信號(hào)，對(duì)異子蓬異型種子產(chǎn)生不同的影響從而表現(xiàn)萌發(fā)的差異，這不僅拓寬了種子的萌發(fā)時(shí)間，還分散了單次萌發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提高了幼苗的存活率，有效地保證了種群的成功建立和順利繁殖[66]，由此對(duì)鹽生植物異子蓬在種子階段主動(dòng)適應(yīng)逆境具有重要的生態(tài)學(xué)意義。ABA對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控是一個(gè)十分重要且復(fù)雜的過(guò)程，它與多個(gè)調(diào)控途徑存在互作關(guān)系，全面深入理解 ABA在植物中的生理功能，將為植物生長(zhǎng)的精細(xì)調(diào)控提供重要的理論基礎(chǔ)。而了解其在植物體內(nèi)的作用方式并應(yīng)用于培育抗逆作物，將為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供有價(jià)值的理論借鑒。

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Effects of exogenous abscisic acid on heteromorphic seed germination ofSuaedaaralocaspica, a typical halophyte of Xinjiang desert region

CAO Jing, LI Xiaorong, WANG Cui, WANG Lu, LAN Xinxin, LAN Haiyan*

XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China

In order to examine the effects of exogenous abscisic acid (ABA) on germination and seedling growth of heteromorphicSuaedaaralocaspicaseeds, we either directly sowed (long-term treatment) or presoaked (short-term treatment) the two seed morphs under different concentrations (0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 μmol/L) of ABA. To further understand the molecular mechanism of exogenous ABA effects on different germination characteristics of heteromorphic seeds ofS.aralocaspica, we examined the expression of three genes with known functions in seed germination:ABC transporter family protein, mitogen-activated protein kinase kinase, and DNA repair and transcription factor. Gene expression was analyzed using quantitative PCR on directly sown and presoaked seeds treated with 5.0 μmol/L ABA. The results revealed two findings:(1) For directly sown seeds, different concentrations of exogenous ABA inhibited germination and seedling growth of brown seeds significantly, while these processes in black seeds were accelerated by lower concentrations of ABA, rather than by higher concentrations. In contrast, pre-soaking promoted germination and seedling growth of both types of seed, and this effect increased at higher concentrations of ABA. (2) Quantitative PCR revealed that, for directly sown brown seeds, only the expression level of the gene for DNA repair and transcription factor increased significantly at 8 h compared to that of control seeds. In black seeds, the genes for DNA repair and transcription factor and for mitogen-activated protein kinase kinase were significantly up regulated compared to those in the control. For pre-soaked seeds, treatment with ABA markedly increased the expression levels of all three genes in brown seeds rather than in black seeds. Expression patterns of the three genes were consistent with the results of seed germination. These results suggest that presoaking with ABA may trigger the internal germination mechanism ofS.aralocaspicaseeds and accelerate the subsequent germination process. The stronger response of black seeds to ABA treatment may be an important adaptation to the harsh and unpredictable environment of Xinjiang desert region.

ABA;Suaedaaralocaspica; heteromorphic seeds; seed germination; quantitative PCR; molecular mechanism

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260037, 31060027); 新疆自治區(qū)優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013721013); 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(XJDX0201-2011-03)

2014-05-13; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2014-12-18

10.5846/stxb201405130978

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lanhaiyan@xju.edu.cn

曹婧, 李曉榮, 王翠, 王璐, 蘭欣欣, 蘭海燕.外源激素ABA影響新疆荒漠鹽生植物異子蓬異型種子萌發(fā)機(jī)制.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(20):6666-6677.

Cao J, Li X R, Wang C, Wang L, Lan X X, Lan H Y.Effects of exogenous abscisic acid on heteromorphic seed germination ofSuaedaaralocaspica, a typical halophyte of Xinjiang desert region.Acta Ecologica Sinica,2015,35(20):6666-6677.