陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過程的微生物機(jī)理

張堅(jiān)超，徐鐿欽，陸雅海

北京大學(xué)， 城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100871

陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過程的微生物機(jī)理

張堅(jiān)超，徐鐿欽，陸雅海*

北京大學(xué)， 城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100871

陸地生態(tài)系統(tǒng)存在許多常年性或季節(jié)性缺氧環(huán)境，如：濕地、水稻土、湖泊沉積物、動(dòng)物瘤胃、垃圾填埋場(chǎng)和厭氧生物反應(yīng)器等。每年有大量有機(jī)物質(zhì)進(jìn)入這些環(huán)境，在缺氧條件下發(fā)生厭氧分解。甲烷是有機(jī)質(zhì)厭氧分解的最終產(chǎn)物。產(chǎn)生的甲烷氣體可通過缺氧-有氧界面釋放到大氣，產(chǎn)生溫室效應(yīng)，是重要的溫室氣體。產(chǎn)甲烷過程是缺氧環(huán)境中有機(jī)質(zhì)分解的核心環(huán)節(jié)，而甲烷氧化是缺氧-有氧界面的重要微生物過程。甲烷的產(chǎn)生和氧化過程共同調(diào)控大氣甲烷濃度，是全球碳循環(huán)不可分割的組成部分。對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過程的微生物機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行了概要回顧和綜述。主要內(nèi)容包括：新型產(chǎn)甲烷古菌即第六和第七目產(chǎn)甲烷古菌和嗜冷嗜酸產(chǎn)甲烷古菌的發(fā)現(xiàn)；短鏈脂肪酸中間產(chǎn)物互營(yíng)氧化過程與直接種間電子傳遞機(jī)制；新型甲烷氧化菌包括厭氧甲烷氧化菌和疣微菌屬好氧甲烷氧化菌的發(fā)現(xiàn)；甲烷氧化菌生理生態(tài)與環(huán)境適應(yīng)的新機(jī)制。這些研究進(jìn)展顯著拓展了人們對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化機(jī)理的認(rèn)識(shí)和理解。隨著新一代土壤微生物研究技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，甲烷產(chǎn)生和氧化微生物研究領(lǐng)域?qū)⒚媾R更多機(jī)遇和挑戰(zhàn)，對(duì)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)做了展望。

甲烷產(chǎn)生；甲烷氧化；微生物機(jī)理；新型產(chǎn)甲烷古菌; 直接種間電子傳遞

工業(yè)革命以來(lái)，工農(nóng)業(yè)活動(dòng)、化石燃料的燃燒及毀林開荒等人類活動(dòng)造成二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和氧化亞氮(N2O)等溫室氣體大量排放，由此引發(fā)的全球變化已經(jīng)成為當(dāng)今全人類面臨的重要環(huán)境問題。CH4是重要的溫室氣體，自工業(yè)革命以來(lái)，大氣CH4濃度增加了近2.5倍，已由工業(yè)革命前的715ppb(體積分?jǐn)?shù))增加至2011年的1803 ppb[1]。20世紀(jì)90年代經(jīng)歷了一個(gè)近10年的穩(wěn)定期，但自2007起大氣CH4再度迅速增加[1]。單位質(zhì)量CH4的溫室效應(yīng)是CO2的21倍[2]。目前全球每年的CH4排放量約為500—600 Tg[3]。大氣甲烷來(lái)源可分為人為源和自然源，其中人為源約占三分之二，主要包括畜牧、稻田、采煤、油氣工業(yè)、垃圾填埋以及生物質(zhì)燃燒等；濕地是甲烷排放最主要的自然源。在所有CH4排放源中，約69%的CH4來(lái)源于產(chǎn)甲烷古菌的新陳代謝活動(dòng)[4]。因此，產(chǎn)甲烷古菌是甲烷產(chǎn)生的最重要生物源。

圖1 濕地及水稻土系統(tǒng)的甲烷產(chǎn)生及氧化過程 Fig.1 The production and oxidation of methane from wetlands and paddy soils

盡管產(chǎn)甲烷古菌是大氣甲烷排放的重要生物源，但陸地生態(tài)系統(tǒng)還存在另一類微生物，即甲烷氧化菌，可將甲烷徹底氧化為CO2。甲烷氧化菌在陸地生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布。在森林、草原等甲烷濃度較低的環(huán)境，甲烷氧化菌每年氧化約3千萬(wàn)噸甲烷，是大氣甲烷主要的生物匯[5]。而在濕地、水稻土、垃圾填埋場(chǎng)等甲烷濃度較高的環(huán)境，甲烷氧化菌每年氧化約相當(dāng)于這些環(huán)境中甲烷產(chǎn)生總量的一半[5]。陸地生態(tài)系統(tǒng)向大氣排放甲烷取決于土壤中產(chǎn)甲烷古菌和甲烷氧化菌活動(dòng)的平衡結(jié)果(圖1)。本文對(duì)近年來(lái)陸地生態(tài)系統(tǒng)中甲烷產(chǎn)生和甲烷氧化研究的若干進(jìn)展進(jìn)行綜述，并拋磚引玉提出未來(lái)研究發(fā)展的建議和思考。

1 陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生的微生物機(jī)制

1.1 產(chǎn)甲烷古菌的研究進(jìn)展

陸地生態(tài)系統(tǒng)包括許多自然和人為缺氧環(huán)境，如：濕地、水稻田、動(dòng)物瘤胃、垃圾填埋場(chǎng)、厭氧生物反應(yīng)器等。進(jìn)入缺氧環(huán)境的有機(jī)物質(zhì)一般經(jīng)以下步驟進(jìn)行分解：(1)水解作用，復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成單糖類物質(zhì)，并進(jìn)一步發(fā)酵成脂肪酸、CO2和H2；(2)脂肪酸在互營(yíng)氧化細(xì)菌(Syntrophs)的作用下氧化生成乙酸、CO2和H2；(3)乙酸、H2和CO2分別被乙酸型和氫型產(chǎn)甲烷古菌利用產(chǎn)生甲烷[6]。同型產(chǎn)乙酸細(xì)菌也可將H2/CO2轉(zhuǎn)變成乙酸，并由乙酸型產(chǎn)甲烷古菌轉(zhuǎn)變成甲烷。由此可見, 有機(jī)質(zhì)厭氧降解由上述的厭氧食物鏈協(xié)同進(jìn)行，甲烷是厭氧食物鏈的最終產(chǎn)物，而產(chǎn)甲烷古菌是有機(jī)質(zhì)厭氧降解食物鏈的末端成員。

產(chǎn)甲烷古菌分布十分廣泛，從土壤到湖泊沉積物，從陸地到海洋，從零下低溫環(huán)境到100℃以上的高溫環(huán)境[7]，遍布地球大部分的缺氧環(huán)境，即使在氧氣充足的沙漠區(qū)域，其土壤生物結(jié)皮中也存在活躍產(chǎn)甲烷古菌[8]，它們?cè)诘厍蛱妓匮h(huán)中扮演著重要角色。近10多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)產(chǎn)甲烷古菌的多樣性和生態(tài)功能開展了大量研究，取得了重要進(jìn)展。

1.1.1 嗜冷嗜酸產(chǎn)甲烷古菌

地球約75%的環(huán)境常年平均溫度低于5℃[9]。低溫產(chǎn)甲烷環(huán)境包括高緯度和高海拔的濕地、高山、湖泊沉積物、冰川、永久凍土以及深海沉積物等。在陸地高寒生態(tài)系統(tǒng)，由于漫長(zhǎng)時(shí)期的生物固碳(植物光合固碳)、有機(jī)物沉積及其緩慢的生物降解, 土壤中儲(chǔ)存了大量有機(jī)碳, 在全球碳平衡中起舉足輕重的作用。但高寒生態(tài)系統(tǒng)對(duì)全球變化特別敏感。一方面，全球氣候變暖存在區(qū)域性差異，高寒區(qū)域的氣候變暖速度高于全球平均水平，最近2012年的北極變暖速度約是全球平均水平的2倍[10]。另一方面，甲烷排放通量的測(cè)定表明，高寒生態(tài)系統(tǒng)存在活躍的產(chǎn)甲烷過程，例如：北半球西伯利亞苔原凍土平均每年排放大量甲烷。而我國(guó)青藏高原的若爾蓋濕地，平均海拔3500m，年平均氣溫約1℃，年平均甲烷排放量為0.65 —1.0 Tg[11]。

自然環(huán)境的產(chǎn)甲烷途徑可分為三種，即：利用氫氣還原CO2的氫型途徑，通過乙酸裂解的乙酸型途徑和利用甲基類化合物的甲基型途徑。Kotsyurbenko等[12]研究發(fā)現(xiàn), 在低溫和底物濃度較高條件下，甲烷主要來(lái)源于乙酸裂解途徑。Gro?Kopf等[13]證明低溫和高溫條件下主要產(chǎn)甲烷古菌類型和產(chǎn)甲烷途徑發(fā)生明顯變化：低溫條件下以乙酸型的甲烷鬃菌占主導(dǎo)，而高溫下則以能利用H2/CO2的甲烷胞菌和甲烷八疊球菌為主。這表明，溫度在一定程度上影響產(chǎn)甲烷古菌的群落結(jié)構(gòu)和代謝途徑。其原因可能與低溫條件下氫氣積累促進(jìn)了同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)，同型產(chǎn)乙酸菌與氫型產(chǎn)甲烷古菌競(jìng)爭(zhēng)，將H2/CO2轉(zhuǎn)變成乙酸；而在高溫或中溫條件下，氫型產(chǎn)甲烷古菌比同型產(chǎn)乙酸菌具有更大的熱力學(xué)優(yōu)勢(shì)，使氫型產(chǎn)甲烷途徑漸漸占主導(dǎo)地位[3]。

根據(jù)產(chǎn)甲烷古菌的最適生長(zhǎng)溫度，產(chǎn)甲烷古菌可分為嗜熱菌(最適溫度55℃左右)、極端嗜熱菌(最適溫度高于80℃)、嗜溫菌(最適溫度在35℃左右)和嗜冷菌(最適溫度低于25℃)。目前產(chǎn)甲烷古菌純培養(yǎng)的研究多數(shù)集中在中溫和高溫菌，對(duì)嗜冷產(chǎn)甲烷古菌的研究十分稀少[3]。但近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從南極和高寒濕地等區(qū)域分離培養(yǎng)了若干嗜冷產(chǎn)甲烷古菌。如美國(guó)學(xué)者從南極冰湖分離獲得兩株嗜冷產(chǎn)甲烷古菌，其中Methanogeniumfrigidum的最適生長(zhǎng)溫度在15℃，倍增時(shí)間為2.9d，超過20℃不能生長(zhǎng)[14]，而Methanococcoidesburtonii的最適生長(zhǎng)溫度為23℃，高于28℃不能生長(zhǎng)[15]。我國(guó)學(xué)者從青藏高原若爾蓋濕地分離獲得了1株嗜冷產(chǎn)甲烷古菌Methanolobuspsychrophilus，其最適生長(zhǎng)溫度為18℃，在此條件下，甲醇轉(zhuǎn)化的Km和Vmax值可達(dá)(87.5±0.4) μmol/L和(0.39±0.04) Mm/h，轉(zhuǎn)化效率非常高，但高于25℃不能生長(zhǎng)[16]。為了理解嗜冷產(chǎn)甲烷古菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理，上述菌株的基因組和轉(zhuǎn)錄組都已進(jìn)行了測(cè)序分析。M.burtonii的比較轉(zhuǎn)錄組分析表明，在冷脅迫條件下，其RNA結(jié)合蛋白呈現(xiàn)上調(diào)，使RNA數(shù)量能維持在適合翻譯的水平，另有一些基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，預(yù)計(jì)可導(dǎo)致細(xì)胞表面發(fā)生重構(gòu)，有助于適應(yīng)冷脅迫條件[17]。有意思的是M.burtonii對(duì)冷脅迫響應(yīng)最強(qiáng)烈的10個(gè)轉(zhuǎn)錄子中有7個(gè)為未知功能的編碼基因[18]。這暗示M.burtonii可能利用新的冷適應(yīng)機(jī)制。

高緯度和高海拔的沼澤和泥炭濕地，不僅常年低溫，而且由于有機(jī)質(zhì)的積累，其土壤多呈酸性條件。大多數(shù)產(chǎn)甲烷古菌生長(zhǎng)的pH范圍比較窄，接近中性，在pH6.0—8.0之間。但也有一些嗜酸產(chǎn)甲烷古菌，例如Kuzneceorii在早期的研究中發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)甲烷古菌，可在pH4.0條件下生長(zhǎng)[19]。Maestrojuan和Boone[20]發(fā)現(xiàn)一些甲烷八疊球菌可在pH4.5生長(zhǎng)。而Patel等[21]獲得一株甲烷桿菌純培養(yǎng)(Methanobacteriumespanolae)其最適pH為5.5—6.0。美國(guó)學(xué)者從酸性泥炭沼澤分離獲得了Methanoregulaboonei(菌株 6A8T)，其生長(zhǎng)的最適pH為4.0—4.5 之間[22]。這為研究理解酸性泥炭沼澤的中嗜酸產(chǎn)甲烷的機(jī)理提供重要生物材料。

1.1.2 第六產(chǎn)甲烷古菌目的發(fā)現(xiàn)

產(chǎn)甲烷古菌在分類上屬于廣域古菌門，在1998年之前，學(xué)術(shù)界確認(rèn)由5個(gè)分類目組成，分別為甲烷火球菌目(Methanopyrales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)。關(guān)于產(chǎn)甲烷古菌目的介紹可見表1。1998年，德國(guó)科學(xué)家通過16S rRNA基因片段分析，首次在意大利水稻土中發(fā)現(xiàn)了一類新的產(chǎn)甲烷古菌[23]，并將其命名為RC-I古菌。通過系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)RC-I古菌是位于甲烷八疊球菌目和甲烷微菌目之間的深度分枝[13]。隨后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RC-I含有產(chǎn)甲烷途徑中起關(guān)鍵作用的甲基輔酶M還原酶基因(mcrA)[24]?；?6S rRNA和mcrA基因的大量研究表明RC-I在環(huán)境中廣泛分布，遍布全球不同陸地和沿海的生態(tài)系統(tǒng)。尤其是世界各地的水稻田是RC-I的主要棲居地之一。對(duì)水稻土中古菌群落的分子分析表明，每克水稻土中(干重)約有106—107個(gè)RC-I細(xì)胞，占總產(chǎn)甲烷古菌數(shù)量的20%—50%[25]。研究發(fā)現(xiàn)，與其他產(chǎn)甲烷古菌相比，RC-I更能適應(yīng)低氫濃度條件[26]；在45—50℃的高溫條件下，RC-I往往占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[27]。應(yīng)用元基因組學(xué)(Metagenomics)方法的研究發(fā)現(xiàn)RC-I還含有一系列編碼抗氧化脅迫的基因，以及利用碳水化合物的基因[28]。對(duì)mcrA基因在稻麥輪作土壤中的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤后，發(fā)現(xiàn)RC-I在排水、低溫、有氧的條件下能夠保持相對(duì)較高的基因表達(dá)水平[29]。RC-I古菌適應(yīng)低氫、抗氧化以及利用有機(jī)物的特性使RC-I在水稻土中具備獨(dú)特的選擇性優(yōu)勢(shì)。

基于穩(wěn)定同位探針技術(shù)(SIP)的研究證實(shí)水稻根際的RC-I在甲烷形成過程中起關(guān)鍵作用[30]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在水稻根際土壤，RC-I比其他氫型甲烷菌具有更高的細(xì)胞密度和甲烷產(chǎn)量[31]。脂肪酸的互營(yíng)氧化是厭氧有機(jī)質(zhì)降解的關(guān)鍵步驟，利用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，RC-I在水稻土中乙酸、丙酸和丁酸的互營(yíng)降解中都起關(guān)鍵作用，證實(shí)RC-I具有適應(yīng)低氫條件的能力[27,32]。通過研究氧氣和硝酸鹽對(duì)水稻土產(chǎn)甲烷菌群落的脅迫影響，證實(shí)了RC-I在水稻田中具有抗氧優(yōu)勢(shì)[27,33-34]。這一系列研究表明RC-I在水稻土甲烷產(chǎn)生過程中可能起關(guān)鍵作用。

但是，盡管分子生態(tài)學(xué)的研究極大的豐富了人們對(duì)RC-I的認(rèn)識(shí)，由于一直缺乏純培養(yǎng)物，使研究人員無(wú)法對(duì)RC-I進(jìn)行更為直接和深入的生理生態(tài)機(jī)制研究。直到2007年，日本研究人員通過利用互營(yíng)共培養(yǎng)的方法，從水稻土獲得了首個(gè)RC-I的純培養(yǎng)物，即菌株SANAE[35]。他們采用不同指標(biāo)對(duì)SANAE進(jìn)行鑒定，確定其為產(chǎn)甲烷古菌的新種，命名為Methanocellapaludicola，并進(jìn)一步確定其代表一個(gè)新目，即：甲烷胞菌目(Methanocellales)。2010年第二株純菌MethanocellaarvoryzaeMRE50被成功分離[36]。經(jīng)過數(shù)年努力，本文作者的實(shí)驗(yàn)室于2012年從中國(guó)水稻土獲得了第三株純菌，命名為MethanocellaconradiiHZ254[37]。與前兩株純菌相比，HZ254菌株具有生長(zhǎng)快速、易培養(yǎng)的特性，為深入研究甲烷胞菌的生理生化機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。至此，三株純菌的分離培養(yǎng)確認(rèn)了第六目產(chǎn)甲烷古菌的分類地位。目前，三個(gè)甲烷胞菌菌株的基因組已全部測(cè)序[38]，其基因組、轉(zhuǎn)錄組和一系列生理生化的研究為深入理解甲烷胞菌目的生態(tài)功能提供了理論基礎(chǔ)。

1.1.3 第七產(chǎn)甲烷古菌目的發(fā)現(xiàn)

土壤生態(tài)系統(tǒng)棲息著不同類型的動(dòng)物，包括小型動(dòng)物如白蟻、蚯蚓等，它們?cè)谕寥烙袡C(jī)物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化過程中起非常重要的作用。白蟻屬于節(jié)肢動(dòng)物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，以木材或纖維素為食。大量基于16S rRNA和mcrA分析的研究表明，白蟻腸道存在一類新型古菌，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與熱原體目(Thermoplasmatales)比較接近[39]。追溯Genebank中相關(guān)的16S rRNA基因發(fā)現(xiàn)，這類古菌可能在深海沉積物、水稻土、湖泊水體和沉積物、垃圾填埋場(chǎng)和厭氧反應(yīng)器等中廣泛存在。不僅如此，這類古菌在瘤胃和哺乳動(dòng)物腸道中經(jīng)常表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌群。Mihajlovski等[40]最早在人類腸道排泄物中探測(cè)到這類古菌，確定為產(chǎn)甲烷古菌，并指出它們代表產(chǎn)甲烷古菌的一個(gè)新目。Wright等[41]也發(fā)現(xiàn)它們是牛瘤胃的主要產(chǎn)甲烷古菌。這些研究一定程度上反映了這類新型產(chǎn)甲烷古菌的廣泛分布及潛在功能。

2012年，Dridi等[42]從人類糞便中分離獲得了第一個(gè)純培養(yǎng)物，命名為Methanomassiliicoccusluminyensis，并正式提出第七產(chǎn)甲烷古菌目，即：Methanomassiliicoccales。目前，除這株純菌外，研究人員還從白蟻[39]，人類腸道[43]及厭氧反應(yīng)器[44]中獲得了高度富集的第七產(chǎn)甲烷古菌目的培養(yǎng)物。純菌及這些富集培養(yǎng)物的基因組和生理生化實(shí)驗(yàn)表明，它們屬于甲基型產(chǎn)甲烷古菌，但擁有著獨(dú)特的代謝特性。和一般的專性甲基型產(chǎn)甲烷古菌不同，它們?nèi)鄙賹O2還原為甲基輔酶M的完整路徑[45]，因此這類菌需要額外添加氫氣才能生長(zhǎng)?；蚪M分析表明，它們含有一些基因，可利用H2還原甲醇、甲胺、二甲胺等底物。生理實(shí)驗(yàn)[46]進(jìn)一步證實(shí)M.luminyensis在H2存在條件下才能利用甲胺類物質(zhì)(甲胺，二甲胺，三甲胺)進(jìn)行生長(zhǎng)。

因此，從營(yíng)養(yǎng)角度看，第七產(chǎn)甲烷古菌目既不是典型甲基型產(chǎn)甲烷古菌，也不是氫型產(chǎn)甲烷古菌，屬于兩者的混合營(yíng)養(yǎng)型。

盡管在水稻土、濕地和湖泊沉積物等自然環(huán)境中經(jīng)常探測(cè)到與第七產(chǎn)甲烷古菌目十分相似的16S rRNA基因片段，但它們是否在這些環(huán)境的甲烷產(chǎn)生和排放中起重要作用，目前尚不清楚。但在草原反芻動(dòng)物和熱帶亞熱帶森林土壤的白蟻腸道，這類產(chǎn)甲烷古菌的功能已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

表1 產(chǎn)甲烷古菌目特征介紹

1.2 互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程研究進(jìn)展

在水稻土和濕地環(huán)境，有機(jī)物質(zhì)的厭氧降解主要包括水解、產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷三個(gè)過程，涉及初級(jí)發(fā)酵菌，次級(jí)發(fā)酵菌，同型產(chǎn)乙酸菌，氫型和乙酸型產(chǎn)甲烷古菌五類功能微生物[47]?；I(yíng)產(chǎn)甲烷是整個(gè)過程中非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)?；I(yíng)是一種特殊的共生關(guān)系，能夠使兩種不同代謝類型的微生物所釋放的有限能量得到最大限度的利用，有著重要的微生物生態(tài)學(xué)意義?；I(yíng)關(guān)系的建立及相互作用方式一直是國(guó)內(nèi)外研究關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其體現(xiàn)在種間電子的傳遞機(jī)制上[48]。它不僅決定了有機(jī)物質(zhì)降解產(chǎn)甲烷過程的效率，還是產(chǎn)甲烷古菌與互營(yíng)菌克服熱力學(xué)壁壘維持生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[48-49]。

1.2.1 種間氫/甲酸傳遞

在大多數(shù)互營(yíng)產(chǎn)甲烷環(huán)境中，H2扮演了非常重要的角色。不僅分子量小、容易擴(kuò)散，而且產(chǎn)甲烷古菌和細(xì)菌體內(nèi)還富含各種氫酶和脫氫酶，H2的形成和氧化需要這些酶的作用[50-51]?；I(yíng)產(chǎn)甲烷過程的種間H2轉(zhuǎn)移電子傳遞過程如圖2a所示。胞內(nèi)常見的氧化還原介質(zhì)有NADH、FADH2和Ferredoxins(Fd)等。這些介質(zhì)的氧化和質(zhì)子還原的能量問題是互營(yíng)產(chǎn)甲烷途徑的關(guān)鍵[52]。H+/H2氧化還原電位較低(E0′=-414mV)，NAD+/NADH和FADH/FADH2的氧化還原電位分別為-320mV和-220mV，而Fd(ox)/Fd(red)維持在-398mV或更低。在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，上述氧化還原介質(zhì)難以作為電子供體還原H+形成H2，但如果能降低H2分壓直至低于1Pa時(shí)，各反應(yīng)的自由能可發(fā)生顯著變化，有的從吸熱反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉艧岱磻?yīng)。這就表明，在互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程中，必須使H2分壓維持在很低的水平。在產(chǎn)甲烷古菌與互營(yíng)氧化菌的互營(yíng)體系中，互營(yíng)氧化菌能夠通過膜結(jié)合的甲酸脫氫酶將甲酸裂解產(chǎn)生H2，而產(chǎn)甲烷古菌不斷消耗H2維持自身生長(zhǎng)，H2能夠依賴氧化還原介質(zhì)在種間發(fā)生傳遞從而降低整個(gè)反應(yīng)體系的H2分壓，最終使反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)質(zhì)子的還原和能量的轉(zhuǎn)化。產(chǎn)甲烷古菌大多利用H2還原CO2，菌體內(nèi)細(xì)胞色素的存在與否，對(duì)臨界H2分壓有一定的影響[53]，例如，不含細(xì)胞色素的產(chǎn)甲烷古菌能夠使H2維持在更低的水平，在互營(yíng)作用中起關(guān)鍵作用。

然而H2并非是電子傳遞的唯一載體，甲酸已被預(yù)測(cè)為是另一種電子穿梭體[54]。甲酸不僅可以產(chǎn)生H2,直接參與CH4的生成，而且甲酸/CO2的氧化還原電位(-432 mV)與H+/H2的(-432 mV)相同。目前種間H2或甲酸轉(zhuǎn)移兩種途徑誰(shuí)占主導(dǎo)并沒有定論。在不同自然或人工環(huán)境中，它們對(duì)互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程的相對(duì)貢獻(xiàn)可能有所不同，迅速發(fā)展的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)將有利于開展這方面的深入研究。

圖2 互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程H2載體電子傳遞及直接種間電子傳遞示意圖Fig.2 Schematic diagrams of H2 mediated electron transfer and direct interspecies electron transfer in syntrophic-methanogenic associations

1.2.2 直接種間電子傳遞

直接種間電子傳遞(DIET)是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程中存在的新型電子傳遞機(jī)制。早在20世紀(jì)80年代，Lovley等[55-56]證明了電子受體Fe(Ⅲ)能夠接受微生物釋放至胞外的電子并產(chǎn)生超細(xì)粒磁鐵礦，開啟了研究胞外直接電子轉(zhuǎn)移(Direct extracellular electron transfer, DEET)的先河。此后，有大量文獻(xiàn)對(duì)DEET的形成機(jī)制進(jìn)行報(bào)道[57]。DEET指微生物將胞內(nèi)產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到胞外供電子受體接受發(fā)生反應(yīng)。常見的電子受體包括Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、腐殖質(zhì)等不可溶物質(zhì)，部分微生物可利用電極或另一類微生物細(xì)胞。我們把以微生物為電子受體的胞外直接電子轉(zhuǎn)移(DEET)稱為直接種間電子傳遞(DIET)。DIET和DEET最大的不同之處在于電子受體為微生物體內(nèi)存在或分泌的細(xì)胞物質(zhì)[55]。DIET如圖2b所示。有關(guān)DIET的證據(jù)最早在地桿菌的共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)[58]。兩株地桿菌在以乙醇為底物的共培養(yǎng)條件下能夠形成直徑1—2 mm、導(dǎo)電的二菌團(tuán)聚體(dual-species aggregates)，在排除種間氫轉(zhuǎn)移的情況下，研究者推測(cè)二菌團(tuán)聚體發(fā)生了種間直接電子傳遞。Morita等[59]在生物反應(yīng)器的產(chǎn)甲烷過程中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)從上流式厭氧污泥床反應(yīng)器提取的微生物團(tuán)聚體導(dǎo)電性是上述地桿菌團(tuán)聚體的三倍，并且該體系無(wú)法實(shí)現(xiàn)氫轉(zhuǎn)移途徑，表明DIET是互營(yíng)產(chǎn)甲烷過程的另一種重要機(jī)制。

目前，DIET的機(jī)制主要包括以下幾種。一是通過細(xì)胞膜上的細(xì)胞色素c介導(dǎo)將電子傳遞給受體，Summers等[58]證實(shí)地桿菌之間具有導(dǎo)電性的團(tuán)聚體是依靠地桿菌細(xì)胞膜上的細(xì)胞色素c形成的。而且通過基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)[57]，地桿菌在細(xì)胞色素c含量較低時(shí)無(wú)法進(jìn)行胞外電子傳遞，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞色素c的重要性。二是通過菌毛(Pili)等細(xì)胞附屬物[60]實(shí)現(xiàn)胞外電子傳遞，菌毛具有很強(qiáng)的導(dǎo)電性。Malvankar等[61]發(fā)現(xiàn)菌毛蛋白能夠作為分子導(dǎo)線實(shí)現(xiàn)電子傳遞。三是主要借助自身所分泌的吩嗪類色素(Phenazine)[62]、核黃素(Flavin)[63]和醌類(Quinones)[64]等氧化還原電子穿梭體實(shí)現(xiàn)電子傳遞。此外，研究表明粒狀活性炭[65]、(半)導(dǎo)體鐵氧化物[66]、生物炭[67]等材料對(duì)DIET有極大的促進(jìn)作用。

最近，本文作者的實(shí)驗(yàn)室利用富集培養(yǎng)的方法對(duì)水稻土壤中丁酸互營(yíng)氧化產(chǎn)甲烷過程進(jìn)行了研究[68]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在富集培養(yǎng)體系中添加納米磁鐵礦顯著促進(jìn)了產(chǎn)甲烷過程，而如果使磁鐵礦外表包裹一層SiO2進(jìn)行絕緣處理，其對(duì)產(chǎn)甲烷過程的促進(jìn)作用隨即消失，這表明納米磁鐵礦的導(dǎo)電性起了重要作用。進(jìn)一步用納米石墨顆粒替代納米磁鐵礦，發(fā)現(xiàn)同樣能對(duì)產(chǎn)甲烷過程起促進(jìn)作用。掃描電鏡觀察顯示納米顆粒緊密附著在不同形態(tài)的細(xì)胞表面，將不同細(xì)胞聯(lián)接起來(lái)。這些結(jié)果首次表明種間直接電子傳遞可能在丁酸互營(yíng)氧化過程中起重要作用。該發(fā)現(xiàn)具有重要實(shí)際意義，因?yàn)樵谕寥篮统练e物等自然環(huán)境廣泛分布著導(dǎo)電性納米礦物，如磁鐵礦和黃鐵礦等。過去很多這些環(huán)境的研究忽略了無(wú)機(jī)礦物可能引起的特殊生態(tài)作用。

2 陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷氧化的微生物機(jī)理

甲烷氧化菌是一類獨(dú)特的微生物，廣泛分布在不同環(huán)境，它們能將甲烷徹底氧化成CO2和水，是地球系統(tǒng)甲烷排放的天然消減器。最近20年來(lái)，針對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)甲烷氧化菌的研究取得了顯著進(jìn)展。

好氧甲烷氧化菌傳統(tǒng)上都屬于變形細(xì)菌門(Proteobacteria)，根據(jù)細(xì)胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、磷脂脂肪酸成分和碳同化途徑等可將好氧甲烷氧化菌分成Ⅰ型菌和Ⅱ型菌。Ⅰ型菌屬γ-變形細(xì)菌，利用5-磷酸核酮糖同化途徑(RuMP)，包括甲基桿菌(Methylobacter)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基單胞菌(Methylomonas)、甲基微菌(Methylomicrobium)和甲基八疊球菌(Methylosarcina)等12屬；Ⅱ型菌屬α-變形細(xì)菌，利用絲氨酸(Serine)同化途徑，包括甲基彎曲菌(Methylosinus)和甲基孢囊菌(Methylocystis)等4屬[69-70]。Ⅰ型菌可進(jìn)一步分成Ⅰa亞型和Ⅰb亞型，Ⅰb亞型菌(Methylococcus和Methylocaldum)同時(shí)擁有RuMP和絲氨酸途徑，因此兼有Ⅰ型菌和Ⅱ型菌的碳同化特征。

2.1 新型甲烷氧化菌

2.1.1 厭氧甲烷氧化過程

近年來(lái)，甲烷氧化菌研究的重要進(jìn)展之一是厭氧甲烷氧化菌的發(fā)現(xiàn)。鑒于甲烷的化學(xué)穩(wěn)定性，長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家認(rèn)為環(huán)境中不可能存在無(wú)氧參與的甲烷氧化。但是生物地球化學(xué)方面的證據(jù)不斷顯示深海沉積物中可能存在厭氧甲烷氧化過程[71]。美國(guó)微生物學(xué)家DeLong領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用穩(wěn)定同位素探針技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)古菌可能催化了海底沉積物的厭氧甲烷氧化[72]，隨后他們采用次級(jí)離子質(zhì)譜技術(shù)(SIMS)證實(shí)厭氧甲烷氧化依靠一類由硫酸鹽還原菌和未培養(yǎng)古菌(ANME)組成的互營(yíng)復(fù)合體[73]。通過元基因組學(xué)(Metagenomics)分析，該小組最終發(fā)現(xiàn)厭氧甲烷氧化實(shí)際上是產(chǎn)甲烷過程的逆向代謝過程[74]。最近，德國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)古菌ANME-2實(shí)際上具備獨(dú)立完成硫酸鹽還原和甲烷氧化兩個(gè)過程的能力[75]。厭氧甲烷氧化的另一個(gè)重大突破是發(fā)現(xiàn)淡水沉積物中存在依賴于反硝化過程的厭氧甲烷氧化[76]。根據(jù)熱力學(xué)原理，與反硝化耦合的厭氧甲烷氧化比與硫酸鹽還原耦合的甲烷氧化更具有熱力學(xué)優(yōu)勢(shì)。因此，研究者推測(cè)在淡水沉積物中可能存在依賴于反硝化過程的厭氧甲烷氧化。荷蘭學(xué)者最早獲得了反硝化甲烷氧化富集物，并通過環(huán)境轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，反硝化甲烷氧化菌實(shí)際上擁有一套完整的好氧甲烷氧化途徑，并擁有一套除N2O還原酶以外的所有反硝化基因[77]。據(jù)此，他們推測(cè)反硝化甲烷氧化菌同時(shí)執(zhí)行了反硝化和好氧甲烷氧化兩個(gè)過程，表明環(huán)境中可能存在一條全新的甲烷氧化途徑。

2.1.2 疣微菌綱甲烷氧化菌

近年來(lái)甲烷氧化菌研究的另一重要突破是發(fā)現(xiàn)了屬于疣微菌綱 (Verrucomicrobia)的好氧甲烷氧化菌。疣微菌廣泛分布在好氧和厭氧環(huán)境中，包括水稻土和湖泊沉積物。但目前分離培養(yǎng)的純菌十分罕見。2007至2008年，國(guó)際上三個(gè)獨(dú)立研究小組分別從富含甲烷的地?zé)岘h(huán)境(溫泉等)分離純化了能進(jìn)行好氧甲烷氧化的疣微菌[78-80]，這是研究者首次發(fā)現(xiàn)不屬于變形細(xì)菌的好氧甲烷氧化菌。疣微菌的分類地位如圖3所示。盡管地域起源不同，三株疣微菌的16S rRNA基因相似度高達(dá)98%以上，因此被歸為同一個(gè)新屬，命名為甲基嗜酸菌(Methylacidiphilum)[81]。這些氧化菌具有嗜熱和極端嗜酸特點(diǎn)，缺乏好氧甲烷氧化菌特有的皺褶內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，但基因組含有三個(gè)完整的pmoCAB操縱子以及一個(gè)單獨(dú)的pmoC拷貝。甲烷氧化疣微菌的發(fā)現(xiàn)顯著拓寬了對(duì)好氧甲烷氧化菌多樣性的認(rèn)識(shí)，但這類氧化菌是否在水稻土和其它生境中存在并具有氧化功能目前還不清楚。用磷脂脂肪酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記的研究顯示，在垃圾填埋土中一些在變形細(xì)菌中不常見的脂肪酸信號(hào)分子如i14:0磷脂脂肪酸受到同位素標(biāo)記[82]，在水稻根際的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[83]，這些研究可能預(yù)示甲烷氧化疣微菌在非極端環(huán)境的生態(tài)功能。

圖3 甲烷氧化菌分類[84]Fig.3 16S rRNA gene phylogeny of the obligate aerobic methane oxidizing bacteria[84]

2.2 甲烷氧化菌的生理生態(tài)特征

2.2.1 高親和力甲烷單加氧酶

甲烷氧化在許多環(huán)境都能發(fā)生，即使在甲烷濃度很低的森林土和旱地土(大氣甲烷濃度)也能檢測(cè)到活躍的甲烷氧化過程。但至今為止純培養(yǎng)研究無(wú)法解釋大氣甲烷濃度下的甲烷氧化。最近,基因組研究揭示有些甲烷氧化菌實(shí)際上擁有兩套pmo基因即pmoCAB1和pmoCAB2，其基因序列差異可達(dá)70%以上[85]。以上提到的甲烷氧化疣微菌即擁有兩套pmo基因。兩套同工酶基因的存在暗示甲烷單加氧酶對(duì)甲烷的親和力可能存在差異，德國(guó)學(xué)者的研究證實(shí)了這一假設(shè)[86]。他們發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌pmoCAB1只在甲烷濃度大于600μL/L時(shí)才起作用(低親和力)，而pmoCAB2能在甲烷濃度小于10 μL/L條件下保持活性(高親和力)。過去大量生態(tài)生理的研究忽略了pmoCAB2的功能。顯然，甲烷氧化菌如果擁有兩套不同親和力的酶，則它們的環(huán)境適應(yīng)能力將顯著提高。對(duì)純菌分析表明大部分Ⅱ型菌擁有兩套pmo基因，而Ⅰ型菌往往只有pmoCAB1。這種差異可能影響它們?cè)谕寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)和功能。

2.2.2 乙酸代謝能力

長(zhǎng)期以來(lái)，學(xué)術(shù)界認(rèn)為甲烷氧化菌是嚴(yán)格的C1利用者(甲烷和甲醇等)，不可能利用多碳化合物如乙酸。但最近有人發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的甲烷氧化菌(Methylocella和Methylocapsa)，能利用乙酸作為獨(dú)立的碳源和能源。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在濕地土壤中廣泛存在的甲基孢囊菌屬(Methylocystis)具有乙酸利用能力，且在甲烷存在時(shí)，乙酸利用效率更高[87]。甲烷氧化菌的乙酸利用能力具有重要生態(tài)學(xué)意義，因?yàn)樵跐竦睾退就?，乙酸是有機(jī)質(zhì)降解的主要中間產(chǎn)物，而這些環(huán)境中甲烷生產(chǎn)通常呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化，乙酸利用能力可使這些甲烷氧化菌具有更強(qiáng)的生存適應(yīng)能力。

2.2.3 厭氧發(fā)酵作用

除乙酸利用能力外，一些甲烷氧化菌還可能擁有更為復(fù)雜的厭氧代謝能力，最近有研究表明在低氧(5%—10% O2)條件下，甲基孢囊菌能利用甲烷在胞內(nèi)合成羥基丁酸聚合物(PHB)。當(dāng)環(huán)境條件由低氧變成無(wú)氧時(shí)，甲烷氧化菌能用PHB進(jìn)行厭氧發(fā)酵[88]，供生存需要。另外，厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物包括乙酸、丙酮和琥珀酸可釋放到環(huán)境，供其它微生物利用，形成由甲烷驅(qū)動(dòng)的食物鏈[89]。PHB是許多細(xì)菌抵御不良環(huán)境的能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)，擁有PHB代謝能力將使甲烷氧化菌更能適應(yīng)有氧與無(wú)氧交替變化的環(huán)境。

另外，作者實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型氧化菌主要分布在水稻的根際和表層土，而Ⅱ型菌則在下層無(wú)氧區(qū)域占優(yōu)勢(shì)[90]。不少研究也表明Ⅱ型菌更能適應(yīng)低氧環(huán)境[91]。但是，這些生態(tài)分布特點(diǎn)是否與Ⅱ型菌的厭氧代謝有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3 展望

甲烷產(chǎn)生和氧化是陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要環(huán)節(jié)?？v觀過去20年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)甲烷產(chǎn)生和氧化過程及其微生物的研究，可以看出，為了理解不同環(huán)境中甲烷產(chǎn)生和氧化過程的機(jī)制，并探索起關(guān)鍵作用的微生物種類和生理生態(tài)功能，研究工作已經(jīng)取得了許多突破性進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一系列新型產(chǎn)甲烷古菌和甲烷氧化菌，揭示了特殊生理生態(tài)機(jī)制。這些創(chuàng)新突破十分依賴于關(guān)鍵科學(xué)問題的牽引、研究方法與技術(shù)的發(fā)展以及多學(xué)科交叉發(fā)展的推動(dòng)。未來(lái)研究的科學(xué)問題如下：

第一，甲烷產(chǎn)生和氧化微生物適應(yīng)環(huán)境變化的機(jī)理和理論。微生物不斷改變環(huán)境，并受到變化環(huán)境的影響不斷適應(yīng)環(huán)境。微生物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)機(jī)理是土壤微生物學(xué)的基本科學(xué)命題，但目前尚未形成相關(guān)理論體系。過去大量研究探索了環(huán)境因子對(duì)甲烷產(chǎn)生和氧化微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，但大部分工作停留在群落水平，在分子和細(xì)胞水平的研究相對(duì)缺乏。如何從分子和細(xì)胞水平通過尺度放大，探究甲烷產(chǎn)生和氧化微生物與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系，揭示對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)機(jī)理，將是未來(lái)相關(guān)研究的重要挑戰(zhàn)。

第二，甲烷產(chǎn)生和氧化微生物的新型菌群和代謝途徑。大量環(huán)境微生物學(xué)的研究表明，目前已知的微生物種類不足實(shí)際存在的1%。這暗示環(huán)境中可能仍存在大量未知的甲烷產(chǎn)生和氧化微生物。新型微生物種類極有可能擁有新的代謝途徑，包括全新的甲烷產(chǎn)生和氧化途徑以及微生物種間相互作用關(guān)系。過去的研究進(jìn)展已經(jīng)證明這一觀點(diǎn)。無(wú)疑，新型菌種及新途徑的發(fā)現(xiàn)將繼續(xù)成為未來(lái)研究的焦點(diǎn)。

第三，研究方法的創(chuàng)新發(fā)展和學(xué)科交叉。近年來(lái)，一系列新的研究方法和技術(shù)，包括：環(huán)境基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及其與SIP技術(shù)的結(jié)合、單細(xì)胞分離培養(yǎng)和測(cè)序技術(shù)、NanoSIMS技術(shù)(高分辨率二級(jí)離子質(zhì)譜)、電化學(xué)研究方法和超分辨率熒光顯微鏡技術(shù)等正在迅速發(fā)展。這些方法技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，無(wú)疑將推動(dòng)甲烷產(chǎn)生和甲烷氧化微生物的研究取得更多創(chuàng)新與發(fā)展。

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Microbial mechanisms of methane production and oxidation in terrestrial ecosystems

ZHANG Jianchao, XU Yiqin, LU Yahai*

CollegeofUrbanandEnvironmentalSciences,PekingUniversity,Beijing100871,China

Terrestrial ecosystems consist of oxic and anoxic environments. Anoxic environments can be permanent or temporary, and they include natural wetlands, paddy field soils, lake and river sediments, rumens, landfills, and anaerobic bioreactors. Large amounts of organic matter are released into these environments annually. Under anoxic conditions, organic matter is decomposed anaerobically, with methane (CH4) as the final product. CH4can diffuse through the anoxic-oxic interface and enter the atmosphere, and can become a potent greenhouse gas. Methanogenesis appears to be the core process of organic matter decomposition in anoxic environments. Methane oxidation takes place actively in the anoxic-oxic interface through which CH4diffuses. Microbial production and oxidation of CH4in terrestrial ecosystems together regulate the atmospheric concentration of CH4and contribute to a crucial part of global carbon cycling. In this review, we report the recent advances in the mechanistic understanding of microbial CH4production and oxidation in terrestrial ecosystems. The major topics include: discovery of novel methanogens, particularly of the psychrophilic and acidophilic methanogens, and the 6thand 7thorders of methanogens; syntrophic interaction and direct interspecies electron transfer in the methanogenic oxidation of short-chain fatty acids; the discovery of novel methanotrophs, including anaerobic and aerobic verrucomicrobial methanotrophs; and the novel ecophysiological properties of methanotrophs. These advances have greatly increased our understanding of microbial CH4production and oxidation in terrestrial ecosystems, and with the development of new methods and technologies, more breakthroughs are expected. We also propose a few perspectives for future studies.

methane production; methane oxidation; microbial mechanisms; novel methanogens; direct interspecies electron transfer (DIET)

國(guó)家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(41130527)

2015-07-09;

2015-08-12

10.5846/stxb201507091459

*通訊作者Corresponding author.E-mail: luyh@pku.edu.cn

張堅(jiān)超，徐鐿欽，陸雅海.陸地生態(tài)系統(tǒng)甲烷產(chǎn)生和氧化過程的微生物機(jī)理.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(20):6592-6603.

Zhang J C, Xu Y Q, Lu Y H.Microbial mechanisms of methane production and oxidation in terrestrial ecosystems.Acta Ecologica Sinica,2015,35(20):6592-6603.