人工種植與道地野生的金蓮花藥用品質(zhì)比較及超聲波提取多糖工藝優(yōu)化

梁永鋒

摘要：為測定人工種植的金蓮花（Trollius chinensis Bunge）中多糖提取率和探索超聲波輻射輔助下多糖提取的最佳工藝，并通過人工種植與道地野生的金蓮花中多糖提取率的比較，實施對人工種植金蓮花的藥用品質(zhì)評價；試驗在超聲波輻射下，用水提醇沉法提取金蓮花多糖、三氯乙酸法除去蛋白、苯酚-硫酸法測多糖含量，通過單因素試驗和正交試驗，比較了超聲波輻射條件下超聲波輻射功率、超聲波輻射時間、料液比、提取溫度對多糖提取率的影響。結(jié)果人工種植的金蓮花多糖提取率為2.94 %，最佳提取工藝條件是超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、超聲波輻射時間30 min、提取溫度80 ℃。這個結(jié)果顯示人工種植的金蓮花多糖含量較高，完全能滿足藥用需求。

關(guān)鍵詞：金蓮花（Trollius chinensis Bunge）；人工種植；多糖；提取工藝；藥用品質(zhì)；評價

中圖分類號：Q949.746.5；Q539；R282.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5456-04

植物多糖具有抗感染、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒、降血糖、降血壓和增強機體免疫力等重要的藥理作用[1]，且植物多糖來源廣泛、毒副作用低、安全性好、無致癌作用[2]。中藥金蓮花為毛茛科（Ranunculaceae）植物金蓮花屬（Trollius L.）金蓮花（T. chinensis Bunge）的花、花蕾干燥品，其味苦、性寒、無毒，可治療口瘡喉腫、浮熱牙宣、耳疼目痛等癥[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治療慢性扁桃體炎、急性鼓膜炎、發(fā)燒、感冒、尿路感染等病。研究表明，金蓮花中主要含有黃酮類、有機酸、糖類、蛋白質(zhì)等[4]成分；目前對野生金蓮花的蛋白質(zhì)、黃酮類、有機酸類化合物的提取分離和藥理活性進行了廣泛的研究[5-9]，而對人工種植的金蓮花和野生金蓮花的多糖提取分離的報道不多。隨著市場需求量的不斷增加，野生金蓮花已經(jīng)遠遠不能滿足需求；近年來各地人工種植金蓮花的規(guī)模越來越大，人工種植金蓮花的藥用品質(zhì)也越來越受到廣泛的關(guān)注。試驗對超聲波提取多糖的影響因素及工藝條件進行了探索與優(yōu)化，分析了寧夏回族自治區(qū)隆德縣種植的金蓮花多糖的提取率，通過人工種植與道地野生金蓮花多糖提取率的比較，對人工種植金蓮花的藥用品質(zhì)進行了評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗用試劑有石油醚、丙酮、80%乙醇、95%乙醇、苯酚、H2SO4（98%）、NaOH、葡萄糖、無水乙醇、CHCl3、正丁醇等，均為國產(chǎn)分析純，水為純凈水。

儀器主要有UV-2450型紫外可見光分光光度計（日本株式會社島津制作所）、FW-177型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、101-1AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、DZ-2BCII標(biāo)準(zhǔn)型真空干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、750型超聲波處理器（美國Sonica公司）、 pHs-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、L-S電子天平（梅特勒-托利多儀器公司，感量萬分之一）。

1.2 藥材及處理

人工種植的金蓮花采自寧夏回族自治區(qū)隆德縣西北中藥材有限責(zé)任公司種植基地；分別產(chǎn)于山西省五臺山、河北省承德市、吉林省長白山、內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市的野生金蓮花購于寧夏明德中藥飲片有限公司，由注冊藥劑師鑒定。將人工種植和野生的金蓮花樣品分別放入恒溫箱中，烘干至恒重，取出后自然陰干，粉碎，過80目篩，依次用石油醚、丙酮處理2 次，除去脂類和色素，再用80 %乙醇處理2次，除去單糖、低聚糖苷類等物質(zhì)，干燥至恒重，得到預(yù)處理的5個產(chǎn)地的金蓮花樣品，備用。

1.3 多糖提取方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取適量葡萄糖于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘至恒重[10]，精確稱取10.0 mg，加純水溶解并定容至100 mL，配置成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于25 mL具塞刻度試管中，再分別以純水補至2.0 mL，依次加入5 %苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，振搖均勻，靜置 20 min；以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的空白為參比，在分光光度計490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)（x），相對應(yīng)的葡萄糖含量為縱坐標(biāo)（y），則標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.083 3 x-0.000 67，R2=0.998 7；這個方程表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 金蓮花多糖的提取 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的金蓮花樣品1.00 g，加適量純凈水于50 ℃浸泡，按各種提取條件（料液比、超聲波輻射功率、超聲波輻射時間、提取溫度）進行超聲波提??；在4 000 r/min離心15 min后取上清液，將濾渣在同樣的條件下再浸提1次，合并2次所得濾液，減壓濃縮，向濃縮液中加入1/4體積的5 %三氯乙酸溶液，混合30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)2 次，至無明顯沉淀為止。向上清液中緩緩加入95%的乙醇，并用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇濃度達到80 %。靜置 4～5 h，4 000 r/min 離心 5 min，過濾沉淀物即為粗多糖，再于40 ℃環(huán)境中真空干燥，干燥后稱重。

1.3.3 多糖含量的測定 準(zhǔn)確稱取 20.00 mg多糖粗品溶于水中， 定容于250 mL 容量瓶中，用分光光度計測定波長490 nm處的樣品吸光度，按下式計算多糖提取率。

多糖提取率=[（m1×y×250）/20×m2]×100%；

式中，m1為從金蓮花樣品中提取的粗多糖質(zhì)量（g），m2為金蓮花樣品質(zhì)量（g），y為標(biāo)準(zhǔn)方程計算所得到的多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.4 多糖提取工藝試驗

1.4.1 單因素提取比較 ①料液比對多糖提取的影響。稱取1.00 g預(yù)處理的人工種植金蓮花樣品5份，設(shè)置超聲波輻射功率300 W、提取溫度80 ℃、超聲波輻射時間30 min、浸泡時間60 min，料液比（金蓮花樣品∶水）處理分別設(shè)置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，比較不同料液比處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。② 超聲波輻射功率對多糖提取的影響。稱取1.00 g預(yù)處理的人工種植金蓮花樣品5份，設(shè)置超聲波輻射時間30 min、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、浸泡時間60 min，超聲波輻射功率處理分別設(shè)置為100、200、300、400、500 W，比較不同超聲波輻射功率處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。③ 提取溫度對多糖提取的影響。稱取1.00 g預(yù)處理的人工種植金蓮花樣品5份，設(shè)置超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、超聲波輻射時間30 min、浸泡時間60 min，提取溫度處理分別設(shè)置為50、60、70、80、90 ℃，比較不同提取溫度處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。④ 超聲波輻射時間對多糖提取的影響。稱取1.00 g預(yù)處理的人工種植金蓮花樣品5份，設(shè)置超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、浸泡時間60 min，超聲波輻射時間處理分別設(shè)置為10、20、30、40、50 min，比較不同超聲波輻射時間處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。

1.4.2 正交試驗篩選 為了綜合考查多項提取因素對多糖提取率的影響，根據(jù)單因素處理的比較結(jié)果，試驗采用L9（34）正交試驗對提取過程中超聲波輻射功率（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和超聲波輻射時間（D）及不同水平進行了研究，并做方差分析，以篩選提取金蓮花中多糖的最佳工藝條件。各因素與水平設(shè)置見表1。

1.4.3 驗證試驗 取預(yù)處理后的人工種植金蓮花樣品，在正交試驗所得到的優(yōu)化提取工藝條件下進行多糖提取，重復(fù)3次，取均值；以驗證正交試驗篩選結(jié)果的真實性與正確性。

1.4.4 不同產(chǎn)地野生金蓮花與人工種植金蓮花多糖提取率比較 將寧夏回族自治區(qū)隆德縣人工種植的金蓮花和分別產(chǎn)于山西省五臺山、河北省承德市、吉林省長白山、內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市的野生金蓮花經(jīng)預(yù)處理后，在正交試驗所得到的優(yōu)化提取工藝條件下進行多糖提取，重復(fù)3次，取均值；比較4個產(chǎn)地野生金蓮花與人工種植金蓮花在多糖提取率方面的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素處理對金蓮花多糖提取的影響

2.1.1 料液比對金蓮花多糖提取的影響 料液比對金蓮花多糖提取的影響結(jié)果見表2。從表2可見，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30處理后，金蓮花多糖提取率依次為1.41%、1.49%、1.61%、1.64%、1.66%，表明多糖的提取率隨料液比的降低而增加。分析認為，這是因為隨著料液比的降低，溶劑與原料充分接觸，增強了二者的傳質(zhì)作用，使多糖的提取率增大；但當(dāng)料液比小于1∶25時，隨著料液比的降低，提取率上升的幅度趨緩，可能是由于當(dāng)金蓮花的多糖絕大部分被溶出后提取率達到了一個穩(wěn)定的水平所致；因此確定料液比1∶25為金蓮花多糖提取的適宜料液比水平。

2.1.2 超聲波輻射功率對多糖提取的影響 超聲波輻射功率對金蓮花多糖提取的影響結(jié)果見表2。從表2可見，超聲波輻射功率分別為100、200、300、400、500 W處理后，金蓮花的多糖提取率分別為1.38%、1.69%、2.16%、2.17%、2.19%，表明隨著超聲波輻射功率的增大，金蓮花多糖的提取率也在增大，可能是隨著超聲波輻射功率的增大，對細胞的破壞作用增強，從而利于多糖的浸出。當(dāng)超聲波輻射功率超過300 W后，多糖提取率的增大明顯趨緩；為節(jié)省能源起見，確定超聲波輻射功率以300 W 為宜。

2.1.3 提取溫度對多糖提取的影響 提取溫度對金蓮花多糖提取的影響結(jié)果見表2。從表2可見，提取溫度分別在50、60、70、80、90 ℃時，金蓮花的多糖提取率分別為1.13%、1.35%、2.16%、2.19%、2.17%，表明在60～80 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，金蓮花多糖的提取率在逐漸增大；而超過80 ℃時多糖提取率反而下降?？紤]到防止多糖在高溫下降解，故確定80 ℃是金蓮花多糖提取的適宜溫度。

2.1.4 超聲波輻射時間對多糖提取的影響 超聲波輻射時間對金蓮花多糖提取的影響結(jié)果見表2。從表2可見，超聲波輻射時間分別是10、20、30、40、50 min時，金蓮花的多糖提取率分別為1.61%、1.65%、1.77%、1.75%、1.72%，說明隨著超聲波輻射時間的延長金蓮花多糖的提取率在逐漸增加，以超聲波輻射30 min時的提取率最高；但是當(dāng)輻射時間大于30 min時，提取率反而降低。這可能是由于多糖的熱穩(wěn)定性較差，隨著超聲波輻射時間的增加造成部分多糖變性，使多糖提取率降低。因此試驗確定的超聲波輻射適宜時間是30 min。

2.2 多因素對金蓮花中多糖提取的影響

根據(jù)單因素處理的比較結(jié)果，試驗確定了4個因素的合理水平進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表3。從表3的直觀分析顯示，影響金蓮花多糖提取的最主要因素是溫度，影響因素大小依次為C>B>D>A，即提取溫度>超聲波輻射功率>超聲波輻射時間>料液比；最佳工藝條件是A2B3C2D2。方差分析結(jié)果顯示（表4），超聲波輻射下提取金蓮花中多糖的影響因素是提取溫度，而超聲波輻射功率、料液比和超聲波輻射時間對多糖的提取無顯著影響，因此，在提取過程中應(yīng)嚴(yán)格控制提取溫度，并要把超聲波輻射功率適當(dāng)降低。

根據(jù)正交試驗結(jié)果的直觀分析和方差分析，綜合考慮，最佳提取工藝為提取溫度80 ℃、料液比1∶25、超聲波輻射功率300 W、超聲波輻射時間30 min。