魔王谷稻瘟病抗性的遺傳分析和基因定位

殷得所　李進(jìn)波　夏明元　等

摘要：采用田間自然誘發(fā)鑒定法，對(duì)持久抗病品種魔王谷和感病品種鄂晚8號(hào)的DH系和F2∶3家系進(jìn)行了抗性遺傳分析和基因初步定位，并使用NBS-LRR同源序列引物進(jìn)行了抗性基因的篩選，揭示魔王谷的抗病機(jī)理。結(jié)果表明，兩個(gè)群體的穗瘟田間抗性由第12染色體RM512標(biāo)記下游的一對(duì)隱性主效基因控制，并在Chr11的RM224下游、Chr7的RM248下游等染色體區(qū)間存在多個(gè)QTLs。NBS-LRR基因序列的篩查也表明在Chr12、Chr8、Chr6、Chr11對(duì)應(yīng)區(qū)間的基因與抗性相關(guān)度較高。

關(guān)鍵詞：稻瘟??；持久抗性；基因定位；NBS-LRR同源序列

中圖分類號(hào)：Q37；Q341 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5346-05

由子囊菌引發(fā)的水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年由稻瘟病造成的稻米產(chǎn)量損失足以養(yǎng)活6 000萬(wàn)人以上，我國(guó)稻瘟病年發(fā)病面積約3.8×106 hm2，發(fā)病面積占水稻種植面積的6%，年損失稻谷約1×109 kg，稻瘟病已成為水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重障礙[1，2]。稻瘟病的防治主要采用化學(xué)防治和抗病新品種培育兩種途徑，化學(xué)防治成本高、效果差且污染環(huán)境，選育和推廣抗病水稻品種被認(rèn)為是控制稻瘟病害最安全、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的方法。

截至2013年8月，至少報(bào)道了68個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)的83個(gè)主效抗性基因[3]。報(bào)道和鑒定了較多持久抗瘟性水稻品種，如Moroberekan、Tetep、OS6、Dourode Perecose、IR36、IR42、IR64以及小粒野生稻、密陽(yáng)30、湘資3150、天津野生稻、魔王谷、谷梅2號(hào)等[4-7]。品種范圍涉及古老的地方品種、栽培稻品種和野生稻。這些抗源品種在稻瘟病的抗病育種中發(fā)揮著重要作用。由于稻瘟病菌容易出現(xiàn)新的生理小種，使得小種?；剐詥适В鄶?shù)抗病品種在推廣種植3～5年后會(huì)出現(xiàn)感病，逐漸喪失抗病性[8，9]。因此，延長(zhǎng)水稻品種的稻瘟病抗性周期成為當(dāng)前水稻抗性育種的主要任務(wù)，而開展廣譜、持久抗性的水稻育種是解決稻瘟病危害最有效且最環(huán)保的途徑。

魔王谷的持久稻瘟病抗性前人已有報(bào)道，本研究采用田間自然發(fā)病的方式，鑒定家系材料的抗病表型，通過(guò)構(gòu)建抗病品種魔王谷與感病品種鄂晚8號(hào)的DH系和F2∶3群體，分析魔王谷的抗性遺傳。SSR標(biāo)記群分法與NBS-LRR同源基因比較結(jié)合，對(duì)抗病基因所在區(qū)間進(jìn)行了初步定位。本研究旨在探求廣譜、持久抗病的遺傳基礎(chǔ)，為抗病基因的精細(xì)定位和克隆以及育種利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

魔王谷為云南稻區(qū)的地方品種，高抗稻瘟病，本試驗(yàn)中作為抗源；鄂晚8號(hào)為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的優(yōu)質(zhì)晚粳品種，高感稻瘟??；9311為江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的優(yōu)質(zhì)中秈品種，高感稻瘟病。

1.2 群體構(gòu)建

2007年以魔王谷為父本，與鄂晚8號(hào)配制雜交組合， F1代植株取花藥進(jìn)行花藥培養(yǎng)， 得到加倍單倍體（DH系）植株113株， 海南移栽并收獲單株種子。

按照單粒傳原則，收獲“鄂晚8號(hào)/魔王谷”組合 F1單株種子，于海南種成F2群體，分單株收獲種子，得到F2∶3家系。2008年春將DH系和F2∶3家系兩個(gè)群體在恩施兩河病圃栽種。

2009年夏在武漢以魔王谷為父本，與9311配制F1雜交組合，再以9311為輪回親本，通過(guò)2次回交和自交，構(gòu)建BC2F3回交滲入系。2012年將263個(gè)BC2F3家系在宜昌遠(yuǎn)安病圃種植。

1.3 田間抗性鑒定和遺傳分析

種子4月初播種，5月初移栽大田，每份家系材料栽插20苗，水肥管理同當(dāng)?shù)厮剑老x不防病。分蘗期調(diào)查葉瘟的發(fā)病率、病級(jí)，抽穗后調(diào)查穗瘟損失率、穗瘟病級(jí)、發(fā)病率等指標(biāo)。按照葉瘟病級(jí)分為1-9級(jí)，穗瘟病級(jí)按0、1、3、5、7、9級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將發(fā)病數(shù)據(jù)制成次數(shù)分布表，進(jìn)行遺傳推斷。

1.4 葉片DNA提取

選取水稻植株葉片組織，采用CTAB法提取水稻基因組DNA。

1.5 引物篩選、設(shè)計(jì)與合成

采用水稻12條染色體上460對(duì)SSR引物進(jìn)行抗、感親本間差異標(biāo)記的篩選，獲得的差異標(biāo)記進(jìn)行連鎖標(biāo)記分析。抗病同源基因引物序列參考Shang等[10]發(fā)表的36對(duì)Psudogene引物進(jìn)行序列設(shè)計(jì)。所有引物由上海生物工程公司合成。

1.6 基因定位

基因分型以魔王谷作為抗病對(duì)照，鄂晚8號(hào)作為感病對(duì)照。采用群分法（Bulked segregant analysis， BSA），用SSR引物進(jìn)行主效抗性基因的初步篩選，選取DH家系中高抗（穗瘟抗級(jí)為0級(jí)）和高感（穗瘟抗級(jí)為9級(jí)）的家系各9個(gè)，分別組成抗、感小群體。利用在魔王谷與鄂晚8號(hào)間的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行連鎖標(biāo)記篩選。

利用從9311和日本晴全基因組序列注釋得到的NBS-LRR同源序列，選取在秈稻基因組中有功能而在粳稻基因組中功能缺失的36個(gè)NBS-LRR基因，作為感病共分離標(biāo)記，進(jìn)行候選基因分析。

按照引物的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行SSR引物和Psudogene基因引物的PCR擴(kuò)增，酶切按照酶的使用說(shuō)明進(jìn)行。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠和6%的聚丙烯酰胺凝膠分離，EB和銀染色后照相，統(tǒng)計(jì)帶型。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間抗性鑒定與遺傳分析

兩個(gè)組合共3個(gè)群體，于2008和2012年分別在恩施和宜昌兩地的病圃進(jìn)行了抗性鑒定?！岸跬?號(hào)/魔王谷”組合的F2∶3家系群體共239個(gè)，在恩施病圃進(jìn)行鑒定。葉瘟發(fā)病表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病則在0級(jí)（高抗）和7級(jí)（高感）處各有一個(gè)高峰，表現(xiàn)為雙峰分布（圖1），抗感比例為64∶161，經(jīng)卡方驗(yàn)證符合1∶3（X2=1.245

DH家系共107個(gè)，葉瘟發(fā)病表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病分布圖在7級(jí)處為分界點(diǎn)（圖2），按1對(duì)隱性基因推斷假設(shè)進(jìn)行卡方驗(yàn)證，抗感比例為44：63，X2=3.03

在宜昌病圃進(jìn)行鑒定的“9311/魔王谷”組合后代BC2F3家系，葉瘟發(fā)病仍然表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病則表現(xiàn)為偏態(tài)分布，且抗性家系明顯偏少（圖3），結(jié)合前2個(gè)群體的發(fā)病分布推斷，其穗瘟主效抗性基因?yàn)殡[性控制模式。

2.2 多態(tài)性標(biāo)記篩選和基因定位

采用群分法（BSA），用84對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)DH家系的抗感小群體進(jìn)行連鎖標(biāo)記篩查，發(fā)現(xiàn)在第11染色體的RM224和第12染色體的RM512兩個(gè)片段區(qū)間的感病基因型和表型符合度高。用這兩個(gè)區(qū)間的引物對(duì)所有的感病DH家系進(jìn)行驗(yàn)證（圖4，圖5），發(fā)現(xiàn)在51個(gè)感病家系中，RM224區(qū)間有16個(gè)重組體，RM512區(qū)間有6個(gè)重組體，RM512位點(diǎn)可以解釋88%的感病表型，因此，將隱性抗病基因初步定位在第12染色體的RM512區(qū)段下游，距離為11.7 cM。

2.3 抗病基因同源序列分析

36對(duì)Psudogene引物先進(jìn)行抗病和感病親本間的差異篩查，所有引物均能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，但經(jīng)過(guò)相應(yīng)的內(nèi)切酶酶解后，只有Psu12、Psu18、Psu19、Psu21、Psu26、Psu28、Psu35、Psu36這8對(duì)引物分別在9311與日本晴和魔王谷與鄂晚8號(hào)間有差異（圖6）。用這些引物對(duì)全體DH家系進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)基因型與表型的符合度（表2），結(jié)果顯示，位于12號(hào)染色體的Psu36抗病同源序列標(biāo)記符合度最高（圖7），這與SSR分型定位的染色體相同。

3 小結(jié)與討論

3.1 關(guān)于田間自然誘發(fā)與抗病表型鑒定

梁斌等[11]用云南省菌株96-5-1a對(duì)魔王谷與麗江新團(tuán)黑谷的F2和BC1F1群體的人工接種鑒定認(rèn)為，魔王谷抗性由1對(duì)顯性基因控制。Sun等[12]用魔王谷與CO39的F2和F8群體進(jìn)行了遺傳分析，采用318-2菌株進(jìn)行人工接種和大田誘發(fā)鑒定，表明魔王谷抗性由1對(duì)顯性基因控制。本研究根據(jù)3個(gè)群體的田間發(fā)病表現(xiàn)分析得出，魔王谷抗性主效基因?yàn)殡[性基因，與前人研究結(jié)論差異較大，是否與鑒定菌系有關(guān)尚不能確定。本研究曾將相同的DH家系同時(shí)在恩施和宜昌病圃進(jìn)行大田自然誘發(fā)鑒定，抗感表型差異很大（實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，未發(fā)表），本試驗(yàn)對(duì)宜昌種植的“9311/魔王谷”的BC2F3群體進(jìn)行了田間抗性鑒定，結(jié)果顯示與恩施病圃的發(fā)病分布不同。說(shuō)明恩施和宜昌兩地的菌株致病能力和毒性可能存在差異，從而導(dǎo)致群體的抗感表現(xiàn)不同。

1998年，Pan等[13]報(bào)道了一份來(lái)自云南當(dāng)?shù)氐母呖沟疚敛∑贩N“Maowanggu”，其抗性由位于第2和第6染色體的2對(duì)顯性基因控制，但對(duì)此地方品種的具體來(lái)源編號(hào)不清楚，無(wú)法與本研究中的魔王谷進(jìn)行比較。

3.2 關(guān)于基因定位群體

本研究使用了“鄂晚8號(hào)/魔王谷”這個(gè)組合的兩個(gè)群體的DH家系和F2∶3家系進(jìn)行表型鑒定和遺傳分析，但主要采用DH家系作為基因定位群體，雖然F2∶3家系數(shù)量較多，定位群體較大，有利于精確定位，但DH家系內(nèi)遺傳背景一致，有利于提高抗性鑒定和標(biāo)記分析的準(zhǔn)確度。另外，本研究使用感病群體作為定位群體，主要為了避免大田誘發(fā)致病環(huán)境中由于熟期等因素導(dǎo)致抗病株的假陽(yáng)性。

3.3 NBS-LRR抗病同源序列與抗性的關(guān)系

水稻秈、粳兩個(gè)亞種完成全基因組測(cè)序后，抗病基因的保守序列研究有了很大進(jìn)展。Shang等[10]根據(jù)秈、粳兩亞種對(duì)稻瘟病抗性的不同機(jī)理，比較了9311和日本晴全基因組內(nèi)NBS-LRR序列的分化，發(fā)現(xiàn)在兩份品種的基因組內(nèi)均存在很多因提前終止或移碼突變導(dǎo)致成為假基因的讀碼框，并且兩個(gè)基因組間假基因的組成和分布也存在很大差異，推測(cè)一個(gè)NBS-LRR功能基因在秈稻中若為抗病基因，則其粳稻中對(duì)應(yīng)的假基因即為感病基因，這個(gè)假基因就可以當(dāng)做感病表型的共分離標(biāo)記進(jìn)行群體分析。用這個(gè)策略鑒定了秈稻品種、地谷中的Pid3抗稻瘟病基因。本研究借鑒此策略鑒定魔王谷的抗病基因。

3.4 基因定位與克隆

Sun等[12]將魔王谷的顯性抗病基因Pi49定位在第11染色體的兩個(gè)SSR標(biāo)記K10和K134間，遺傳距離分別為1.01和1.89 cM，并檢測(cè)到9個(gè)QTLs分布在第2、3、6、8、9、12染色體上。本研究也在第11染色體的RM224下游檢測(cè)到了貢獻(xiàn)率較大的抗病位點(diǎn)，可能與Pi49區(qū)間相同。本研究采用圖位克隆和NBS-LRR同源基因鑒定法，對(duì)魔王谷的抗病相關(guān)基因進(jìn)行了初步定位。群分法（BSA）的結(jié)果顯示，魔王谷的田間抗性除了主效基因外，可能還有其他微效基因參與控制，SSR標(biāo)記分析和NBS-LRR基因篩選也說(shuō)明在第6、8、11染色體上存在與家系表型相關(guān)度較高的標(biāo)記位點(diǎn)。本研究獲得的連鎖標(biāo)記離目標(biāo)基因尚有一定距離，以假基因作為共分離標(biāo)記的試驗(yàn)尚未觀察到與感病表型完全共分離的現(xiàn)象，RM512下游11.7cM的物理位置，大約在8614 402 bp處，與P36的物理位點(diǎn)（18342 097）距離也較遠(yuǎn)。推測(cè)其原因，除了定位群體對(duì)于研究由多基因控制的抗性而言偏小外，還可能是由于感病家系未發(fā)病，導(dǎo)致表型鑒定存在誤差；其次，多基因控制的抗性體現(xiàn)出一定的復(fù)雜性，例如，有些家系丟失了主效抗性基因，但由于微效基因的聚合而同樣產(chǎn)生了抗性，導(dǎo)致表型鑒定的誤差。因此，主效基因的精細(xì)定位乃至克隆還要依賴于定位群體的擴(kuò)大和染色體區(qū)間標(biāo)記的加密來(lái)進(jìn)行深入研究，或者通過(guò)回交和標(biāo)記選擇將主效基因從復(fù)雜的多基因背景中剝離出來(lái)。另外，分離到病圃中的主要致病菌進(jìn)行單孢菌系人工接種，可以得到重復(fù)性更好的表型鑒定，也可能是可行的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫漱沅，孫國(guó)昌.我國(guó)稻瘟病研究的現(xiàn)狀和展望[J].植保技術(shù)與推廣，1996，16（3）：39-40.

[2] 王艷青.近年來(lái)中國(guó)水稻病蟲害發(fā)生及趨勢(shì)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：343-347.

[3] 國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].http：//www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm，2012-06-20.

[4] BONMAN J M， MACKILL D J. Durable resistance to rice blast disease[J]. Oryza， 1988， 25：103-110.

[5] WANG G L， MACKILL D J， BONMAN J M， et al. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar[J]. Genetics， 1994， 136：1421-1434

[6] 彭邵裘，劉二明，黃費(fèi)元，等.水稻持久抗瘟性研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23（4）：293-299.

[7] 羅利民，王云高，羅耀光，等.稻種資源對(duì)稻瘟病的抗譜測(cè)定[J]. 作物品種資源，1996（1）：11-13.

[8] 沈 瑛，朱培良，袁筱萍.中國(guó)稻瘟病菌的遺傳多樣性[J].植物病理學(xué)報(bào)，1993，23（4）：309-313.

[9] 伍尚忠，朱小源，劉 斌，等.秈稻品種三黃占2號(hào)的稻瘟病持久抗性評(píng)價(jià)與遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（4）：528-534.

[10] SHANG J J， TAO Y， CHEN X W，et al. Identification of a new rice blast resistance gene， Pid3， by genomewide comparison of paird nucleotide-binding site-leucine rich repeat genes and their psudogene alleles between the two sequenced rice genome[J]. Genetics， 2009， 182： 1303-1311.

[11] 梁 斌，余騰瓊，徐福榮，等.云南省3個(gè)地方稻種的抗稻瘟病性遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（7）：784-788.

[12] SUN P Y， LIU J L， WANG Y，et al. Moleular mapping of the blast resistance gene Pi49 in the durably resistant rice cultivar Mowanggu[J]. Euphytica， 2013，192：45-54.

[13] PAN Q H， WANG L， IKEHASHI H，et al. Identification of two new genes conferring resistance to rice blast in the Chinese native cultivar ‘Maowangu[J]. Plant Breeding， 1998， 117：27-31.

（責(zé)任編輯 韓 雪）

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫漱沅，孫國(guó)昌.我國(guó)稻瘟病研究的現(xiàn)狀和展望[J].植保技術(shù)與推廣，1996，16（3）：39-40.

[2] 王艷青.近年來(lái)中國(guó)水稻病蟲害發(fā)生及趨勢(shì)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：343-347.

[3] 國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].http：//www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm，2012-06-20.

[4] BONMAN J M， MACKILL D J. Durable resistance to rice blast disease[J]. Oryza， 1988， 25：103-110.

[5] WANG G L， MACKILL D J， BONMAN J M， et al. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar[J]. Genetics， 1994， 136：1421-1434

[6] 彭邵裘，劉二明，黃費(fèi)元，等.水稻持久抗瘟性研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23（4）：293-299.

[7] 羅利民，王云高，羅耀光，等.稻種資源對(duì)稻瘟病的抗譜測(cè)定[J]. 作物品種資源，1996（1）：11-13.

[8] 沈 瑛，朱培良，袁筱萍.中國(guó)稻瘟病菌的遺傳多樣性[J].植物病理學(xué)報(bào)，1993，23（4）：309-313.

[9] 伍尚忠，朱小源，劉 斌，等.秈稻品種三黃占2號(hào)的稻瘟病持久抗性評(píng)價(jià)與遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（4）：528-534.

[10] SHANG J J， TAO Y， CHEN X W，et al. Identification of a new rice blast resistance gene， Pid3， by genomewide comparison of paird nucleotide-binding site-leucine rich repeat genes and their psudogene alleles between the two sequenced rice genome[J]. Genetics， 2009， 182： 1303-1311.

[11] 梁 斌，余騰瓊，徐福榮，等.云南省3個(gè)地方稻種的抗稻瘟病性遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（7）：784-788.

[12] SUN P Y， LIU J L， WANG Y，et al. Moleular mapping of the blast resistance gene Pi49 in the durably resistant rice cultivar Mowanggu[J]. Euphytica， 2013，192：45-54.

[13] PAN Q H， WANG L， IKEHASHI H，et al. Identification of two new genes conferring resistance to rice blast in the Chinese native cultivar ‘Maowangu[J]. Plant Breeding， 1998， 117：27-31.

（責(zé)任編輯 韓 雪）

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫漱沅，孫國(guó)昌.我國(guó)稻瘟病研究的現(xiàn)狀和展望[J].植保技術(shù)與推廣，1996，16（3）：39-40.

[2] 王艷青.近年來(lái)中國(guó)水稻病蟲害發(fā)生及趨勢(shì)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：343-347.

[3] 國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].http：//www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm，2012-06-20.

[4] BONMAN J M， MACKILL D J. Durable resistance to rice blast disease[J]. Oryza， 1988， 25：103-110.

[5] WANG G L， MACKILL D J， BONMAN J M， et al. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar[J]. Genetics， 1994， 136：1421-1434

[6] 彭邵裘，劉二明，黃費(fèi)元，等.水稻持久抗瘟性研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23（4）：293-299.

[7] 羅利民，王云高，羅耀光，等.稻種資源對(duì)稻瘟病的抗譜測(cè)定[J]. 作物品種資源，1996（1）：11-13.

[8] 沈 瑛，朱培良，袁筱萍.中國(guó)稻瘟病菌的遺傳多樣性[J].植物病理學(xué)報(bào)，1993，23（4）：309-313.

[9] 伍尚忠，朱小源，劉 斌，等.秈稻品種三黃占2號(hào)的稻瘟病持久抗性評(píng)價(jià)與遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（4）：528-534.

[10] SHANG J J， TAO Y， CHEN X W，et al. Identification of a new rice blast resistance gene， Pid3， by genomewide comparison of paird nucleotide-binding site-leucine rich repeat genes and their psudogene alleles between the two sequenced rice genome[J]. Genetics， 2009， 182： 1303-1311.

[11] 梁 斌，余騰瓊，徐福榮，等.云南省3個(gè)地方稻種的抗稻瘟病性遺傳分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（7）：784-788.

[12] SUN P Y， LIU J L， WANG Y，et al. Moleular mapping of the blast resistance gene Pi49 in the durably resistant rice cultivar Mowanggu[J]. Euphytica， 2013，192：45-54.

[13] PAN Q H， WANG L， IKEHASHI H，et al. Identification of two new genes conferring resistance to rice blast in the Chinese native cultivar ‘Maowangu[J]. Plant Breeding， 1998， 117：27-31.

（責(zé)任編輯 韓 雪）