蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴物質(zhì)與其耐寒性

易杰群, 張古忍, 郭晨林, 閔 強, 鄒志文,*

1 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031 2 中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,昆蟲研究所, 廣州 510275

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴物質(zhì)與其耐寒性

易杰群1, 張古忍2, 郭晨林1, 閔 強1, 鄒志文1,*

1 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031 2 中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,昆蟲研究所, 廣州 510275

作為冬蟲夏草寄主，蒲氏鉤蝠蛾具重要的經(jīng)濟研究價值,主要分布于青藏高原色季拉山，具有較強的耐寒性，其耐寒性機理尚不明了。通過調(diào)查蒲氏鉤蝠蛾生境土壤溫度與血淋巴物質(zhì)組成周年變化，以期探討其耐寒性機理。實驗結(jié)果表明：土壤溫度呈規(guī)律性升降趨勢，1、2月最低，8月逐步上升至最高，而后逐漸下降；血淋巴中主要物質(zhì)按含量從高到低排列依次為：蛋白質(zhì)(8.37—74.2 mg/mL)、總糖(12.65—36.12 mg/mL)、脂肪(7.7—12.32 mg/mL)以及甘油(1.66—3.91 mg/mL)；在溫度較高的夏季，蛋白質(zhì)、總糖以及脂肪等物質(zhì)含量處于較低水平，相反，在寒冷的冬季，此三者的含量均居較高水平；此3類能源物質(zhì)含量與野外土壤溫度均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，因而血淋巴總熱量值在夏季較低而冬季較高，與野外土壤溫度亦呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與之相反的是，血淋巴中甘油含量的周年變化規(guī)律與野外土壤溫度無明顯的相關(guān)關(guān)系。因此，血淋巴中蛋白質(zhì)、總糖以及脂肪等物質(zhì)對于蒲氏鉤蝠蛾耐寒性有著非常重要的作用，幼蟲通過積累3類物質(zhì)，增加血淋巴能量值，抵御青藏高原的高寒氣候；可能由于生境的不同，甘油在蒲氏鉤蝠蛾中的作用與其它昆蟲有差異，在耐寒性提高中的功能尚需進一步研究。實驗結(jié)果為了解蒲氏鉤蝠蛾的強耐寒性以及適應(yīng)高寒環(huán)境的生理生化機制提供理論依據(jù)。

蒲氏鉤蝠蛾; 耐寒性; 血淋巴物質(zhì)

生物依靠調(diào)節(jié)代謝機制和積累抗寒物質(zhì)來抵御寒冷。耐寒性的昆蟲在蟲體內(nèi)發(fā)生著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。一方面通過降低體內(nèi)游離水分含量，提高體液溶質(zhì)濃度，降低冰點，以防止低溫下冰凍傷害；一方面通過積累耐寒性物質(zhì)，降低體液過冷卻點，增強其耐寒性，昆蟲體內(nèi)某些生化物質(zhì)的增加或減少，影響著過冷卻點的高低[1]。

越冬期間許多昆蟲體內(nèi)積累甘油、多元醇、糖等低分子量的糖或醇，以增加昆蟲體內(nèi)結(jié)合水含量，減少自由水含量，或直接與酶及其他的蛋白質(zhì)相互作用起到保護生物系統(tǒng)的作用。不同昆蟲所積累的物質(zhì)種類和含量不同，但在大多數(shù)昆蟲中都由以上幾種物質(zhì)構(gòu)成一個抗寒物質(zhì)系統(tǒng)，如歐樺小蠹蟲Scolytusratzeburgi幼蟲中的甘油、山梨醇、葡萄糖以及海藻糖會對低溫產(chǎn)生響應(yīng)；桑尺蠖Phthonadriaatrilineata越冬幼蟲和黃地老虎Agrotissegetum幼蟲則是以小分子糖-氨基酸-糖蛋白系統(tǒng)抵御寒冷[2-4]。

蝠蛾幼蟲的強耐寒性已有文獻報道，大多數(shù)種類幼蟲能在-10—-12 ℃溫度下過冬，有些甚至能耐受-20 ℃左右的低溫[5-6],是一種研究耐寒性理想的材料。由于其分布范圍窄，生境特殊，因而在其抗寒性研究方面，已有的報道僅見于白馬鉤蝠蛾Thitarodesbaimaensis(Liang)以及云南蟲草蝠蛾Hepialussp.，其幼蟲能在越冬初期增加體內(nèi)蛋白、糖和脂肪含量，但未對幼蟲血淋巴物質(zhì)進行詳細(xì)研究[7-8]。昆蟲血淋巴是昆蟲體內(nèi)輸送和貯藏營養(yǎng)物質(zhì)的介質(zhì)和場所，是昆蟲生理生化研究的重要材料，對于昆蟲耐寒性機理及機制的研究具有非常重要的作用。

蒲氏鉤蝠蛾T.pui生長在青藏高原的色季拉山，色季拉山雨量豐沛，年降水量650 mm以上。每年自9月底至10月初開始降雪，直至第2年5月份，土壤濕潤且凍土期長[9]。其幼蟲具有較強的耐寒性，本文從蒲氏鉤蝠蛾血淋巴能源物質(zhì)的周年變化入手，探討蒲氏鉤蝠蛾幼蟲適應(yīng)高寒環(huán)境的生理生化機制，為闡明蝠蛾幼蟲強耐寒性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蒲氏鉤蝠蛾的發(fā)生環(huán)境簡介

色季拉山位于西藏林芝縣以東，屬念青唐古拉山脈，是尼洋河流域與帕龍藏布江的分水嶺。該地區(qū)年降水量充沛，年平均氣溫低，冰雪覆蓋長達半年之久，氣壓為平原地區(qū)的60%—70%，氧氣含量僅為內(nèi)陸地區(qū)的40%—50%。2006 年，中山大學(xué)在色季拉山海拔4156 m (29°37′897′′N，94°37′522′′E) 處建立了“中山大學(xué)青藏高原特色資源科學(xué)工作站”，從事冬蟲夏草資源可持續(xù)利用的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用技術(shù)研究。蒲氏鉤蝠蛾是前期工作中發(fā)現(xiàn)的新種[9]，主要分布于色季拉山海拔4100—4650 m的高寒灌木及高寒草甸土壤中，主要植被為低矮灌木及草本植物，土壤表層植物根系密集，堅實而有彈性，富含有機質(zhì)；夏季雨水多，土壤濕潤，冬季寒冷，有凍土形成；全年晝夜溫差大。

1.2 野外土壤周年溫度變化數(shù)據(jù)的采集

溫度/濕度數(shù)據(jù)采集器購自美國Eco Tech公司，型號為適用于野外土壤和空氣溫濕度的記錄的H08-032-08，溫度范圍-20 ℃—50 ℃；因蒲氏鉤蝠蛾大齡幼蟲多分布于地表以下20 cm左右，因此在3處將3個采集器分別埋入地面20 cm深的土壤，設(shè)置每30 min自動記錄1次溫度和濕度數(shù)據(jù)。每隔30 d左右，利用配套的BoxCar Pro軟件讀取數(shù)據(jù)。

1.3 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴的采集

自2008年4月至2009年3月，每月中旬在采集器周圍土壤中隨機采挖蒲氏鉤蝠蛾8齡幼蟲數(shù)頭，帶回工作站。取5頭體型相近幼蟲置于預(yù)冷的冰盒上進行麻醉，酒精棉球消毒蟲體后，毛細(xì)管自腹足取血淋巴，所取血淋巴直接放入置于冰上的預(yù)先加有苯基硫脲的Eppendorf管中，混勻后，4 ℃下10000 r/min離心5 min，-80 ℃?zhèn)溆谩?次重復(fù)。

1.4 總糖含量的測定

參照馮慧的方法，在一定量的血淋巴上清液中加入磺基水楊酸溶液至終濃度為10%，15000 r/min離心10 min以除去蛋白質(zhì)沉淀[10]。取5 μL上清液，加入0.2%蒽酮濃硫酸試劑，在沸水浴中加熱10 min，冷卻后測OD620值。以0.01%的葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 可溶性蛋白濃度的測定

可溶性蛋白的測定依據(jù)Bradford的方法進行測定[11]。取幼蟲血淋巴5 μL，加入考馬斯亮藍(lán)-G 250染色3—5 min，而后于紫外/可見分光光度計中測定樣品OD590。并以1 mg/mL牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 脂肪含量的測定

血淋巴中的脂肪含量采用含磷香草醛酸法測定[12]。取出幼蟲血淋巴5 μL，蒸餾水補足至100 μL后，加入0.5 mL氯仿于室溫靜止10 min；然后加入0.5 mL的濃H2SO4，沸水中加熱10 min，冷卻至室溫。最后加入1 mL含磷香草醛溶液(在14 mol/L的磷酸中加入13 mmol/L香草醛)，混勻后，在室溫下置30 min，測OD547值。以膽固醇(含2.5 mg/mL甲醇)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熱量值總卡路里的計算

參照Graney和Giesy的方法，假定脂類的熱量值為39.748 J/mg，糖的熱量值為17.991J/mg，蛋白的熱量值為17.154J/mg，根據(jù)血淋巴中糖、脂肪和蛋白質(zhì)含量計算總熱量值(×4.184J/mL)[13]。

1.8 甘油含量測定

(1)試劑

過碘酸鈉、無水醋酸氨、冰醋酸、乙酰丙酮、異丙醇、甘油(丙三醇，比重為1.261)，均為國產(chǎn)分析純(AR)。

氧化劑 稱取過碘酸納130 mg，溶于約50 mL蒸餾水中，加入8 g無水醋酸氨，待全部溶解后再加入6 mL冰醋酸，最后加水定容至100 mL，混勻，置棕色瓶中各用。

顯色劑 取乙酰丙酮0.4 mL，加異丙醇至100 mL，混勻，置棕色瓶中備用。

甘油標(biāo)準(zhǔn)液 取甘油1 mL，加水定容至200 mL搖勻，吸取10 mL定容至1000 mL，即得甘油含量為1/20000(或63.05 μg/mL)的甘油標(biāo)準(zhǔn)液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取16支試管，分2組作為2個重復(fù)。分別加入0、100、200、300、400、500、600、700 μL甘油標(biāo)準(zhǔn)液，以蒸餾水補體積到1 mL，使測試標(biāo)準(zhǔn)液的甘油含量分別為0、6.305、12.610、18.915、25.220、31.525、37.830、44.135 μg/mL。每管中加入氧化劑2 mL，搖勻，加入顯色劑2 mL充分混和后，置60 ℃水浴中加熱顯色15 min，流水冷卻。在722型光柵分光光度計上420 nm波長下進行比色分析，用空白管溶液調(diào)零點，記錄透光度值。以甘油含量為縱坐標(biāo)，透光度值為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)測量方法

取血淋巴10 μL，補水至1 mL，如上方法進行測定。

1.9 數(shù)據(jù)分析

能源物質(zhì)、甘油周年變化數(shù)值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換，進行單因素方差分析，并進行多重比較，以闡明差異的顯著性；各種物質(zhì)及能量值與溫度相關(guān)性及線性關(guān)系方程均采用Statistica 8.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)野外土壤溫度變化

2008年4月至2009年3月色季拉山野外蒲氏鉤蝠蛾生境土壤月平均溫度如表1所示。其中最高平均土壤溫度出現(xiàn)在8月，為(11.31±0.26)℃，最低平均土壤溫度出現(xiàn)在1、2月，分別為(-0.01±0.18)℃和(-0.05±0.10)℃。從表1中可以明顯看出，3—8月，平均土壤溫度逐漸上升，8月份后土壤溫度逐漸下降，至1月和2月的土壤月平均溫度低于0 ℃。

表1 色季拉山野外土壤周年月平均溫度及蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴蛋白質(zhì)、總糖、脂肪、能量和甘油周年變化動態(tài)(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)(n=5)

2.2 幼蟲血淋巴蛋白質(zhì)的季節(jié)動態(tài)

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的蛋白質(zhì)與野外土壤溫度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖1)，兩者間的方程式為y=59.238-3.686x(r=-0.789，P=0.002)，在全年溫度最低的1、2月血淋巴蛋白質(zhì)含量最高，在70 mg/mL以上，隨著氣溫的升高而不斷降低，在9月達到最低，為(8.37±5.23)mg/mL。

2.3 幼蟲血淋巴總糖的季節(jié)動態(tài)

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的總糖與野外土壤溫度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)，兩者間的方程式為y=30.437-1.121x(r=-0.760，P=0.004)，在溫度最低的2月血淋巴總糖含量最高，為(36.12±11.25)mg/mL，之后隨著氣溫的的升高而降低，在8月達到最低，為(12.65±4.88)mg/mL。

圖1 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中蛋白質(zhì)與土壤溫度季節(jié)動態(tài)(n=5)Fig.1 Seasonal dynamic of proteins in larvae hemolymph and soil temperature of T.pui (n=5)

圖2 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中總糖與土壤溫度季節(jié)動態(tài)(n=5)Fig.2 Seasonal dynamic of total sugar in larvae hemolymph and soil temperature of T.pui (n=5)

2.4 幼蟲血淋巴脂肪的季節(jié)動態(tài)

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的脂肪與野外土壤溫度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3)，兩者間的方程式為y=11.413-0.307x(r=-0.924，P=0.000)，在全年溫度最低的1、2月血淋巴總糖含量最高，在12 mg/mL以上，高溫環(huán)境下會含量逐漸降低，在7月達到最低，為(7.70±1.10)mg/mL。

2.5 幼蟲血淋巴總熱量值的季節(jié)動態(tài)

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的總熱量值與野外土壤溫度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4)，兩者間的方程式為y=482.180-22.850x(r=-0.860，P=0.000)，在全年溫度最低的1、2月血淋巴總熱量值最高，在2.092 kJ/mL以上，在9月達到最低，為(191.73±22.08)×4.184kJ/mL。

圖3 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中脂肪與土壤溫度季節(jié)動態(tài)(n=5)Fig.3 Seasonal dynamic of fat in larvae hemolymph and soil temperature of T.pui (n=5)

圖4 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中總熱量與土壤溫度季節(jié)動態(tài)(n=5)Fig.4 Seasonal dynamic of gross calorific value in larvae hemolymph and soil temperature of T.pui (n=5)

2.6 幼蟲血淋巴甘油的季節(jié)動態(tài)

圖5 蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中甘油與土壤溫度季節(jié)動態(tài)(n=5) Fig.5 Seasonal dynamic of glycerol in larvae hemolymph and soil temperature of T.pui (n=5)

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的甘油含量與野外土壤溫度不存在明顯的相關(guān)關(guān)系(圖5)，兩者間的方程式為y=2.580 + 0.495x(r=0.283，P=0.370)。

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲蛋白質(zhì)、脂肪、甘油含量及總熱量值從2008年4月至2009年3月的周年變化動態(tài)如表1所示。結(jié)果表明，總糖、蛋白質(zhì)、脂肪及總熱量值的周年變化規(guī)律基本一致，與土壤溫度的變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著土壤溫度的降低而升高，至土壤溫度最低的1月和2月，能量物質(zhì)達到最高峰值，而在溫度最低的7月和8月，能量物質(zhì)達到最低谷值，且峰值和谷值之間差異極顯著。但血淋巴中甘油含量的周年變化規(guī)律正好相反，二者間存在極顯著差異。

3 討論

溫度是影響生物生存的重要因素之一。就昆蟲而言，調(diào)節(jié)代謝及合成抗寒物質(zhì)是兩種有效適應(yīng)低溫的方式。作為重要的運輸及代謝場所，血淋巴內(nèi)組成成份的變化對昆蟲適應(yīng)低溫環(huán)境起到至關(guān)重要的作用。

昆蟲對季節(jié)性溫度差異的反應(yīng)表現(xiàn)為體內(nèi)相關(guān)的耐寒性生化物質(zhì)種類及含量的變化，這些變化影響著過冷卻點的高低，從而決定了其耐寒性的強弱[1]。昆蟲在低溫下，伴隨著體內(nèi)甘油的出現(xiàn)，相應(yīng)也會產(chǎn)生山梨醇、甘露醇、核糖醇、赤蘚糖醇等多元醇。多元醇適合作抗凍保護劑，是因為其具有水溶液中溶解度高、無毒且相溶性好、對酶或代謝過程影響很少、能自由跨膜等特點[14]。它們在生物體內(nèi)起到雙重的作用，一方面增強膜的抗凍保護作用，另一方面可增加細(xì)胞燃料，利用體內(nèi)的糖貯存來產(chǎn)生能量，這些物質(zhì)的積累增加了體液溶質(zhì)的濃度，能有效的降低生物過冷卻點[15]。蝠蛾是一類具有強耐寒性的昆蟲[5-6]，實驗過程中，雖并未測定其過冷卻點，但發(fā)現(xiàn)在-20 ℃其能存活約半個小時，當(dāng)其包裹于土壤中時，存活時間將延長(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

蛋白質(zhì)是組成蟲體的最基本的物質(zhì)之一，許多越冬昆蟲的幼蟲以蛋白質(zhì)作為其主要抗寒物質(zhì)，增強自身的抗寒能力，以適應(yīng)外界低溫的變化。本文章蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中蛋白質(zhì)含量與溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)則證實了此點，這與桑尺蠖、卡尼鄂拉蜂、意蜂、赤松毛蟲幼蟲及黃地老虎幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)在低溫季節(jié)的表現(xiàn)相似[1,3-4,16-17]。目前在昆蟲耐寒性研究中涉及最多的是抗凍蛋白和熱激蛋白等，并已取得了顯著地成果?？箖龅鞍字饕谥倔w中合成，隨后釋放到血淋巴中，可以通過熱滯效應(yīng)有效地抑制冰晶在生物體內(nèi)的生成和增長[18]。而熱激蛋白在增加耐寒性上的主要作用是作為分子伴侶幫助蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移至作用部位，具有幫助修復(fù)受損蛋白，維持其正常功能[19]。研究表明，蒲氏鉤蝠蛾熱激蛋白與耐寒性具有緊密的聯(lián)系，其熱激蛋白90基因表達與環(huán)境溫度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[20]。

在蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中，總糖含量同樣與溫度存在極顯著的負(fù)相關(guān)性。糖類的作用是降低溶液過冷卻點和提供越冬期間需要的能量。在低溫季節(jié)保持較高水平，這與降低停止活動幼蟲體液的過冷卻點并提供能量密切相關(guān)。在黃地老虎、西藏飛蝗5齡蝻、赤松毛蟲和松阿扁葉蜂幼蟲研究中有類似報道[1，4,21-22]。在生物體多種應(yīng)對非生物協(xié)迫的方式中，海藻糖的積累是一種較為普遍的方式[23]，昆蟲也不例外。作為血淋巴中最主要的糖類物質(zhì)，海藻糖不僅可以作為能源物質(zhì)以應(yīng)對低溫，同樣還可以降低溶液過冷卻點，保證機體正常生命活動[24]。還有報道指出，海藻糖可以在低溫時保護蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜維持正常結(jié)構(gòu)[25-26]。但是有關(guān)海藻糖提升昆蟲耐寒性的具體機制，目前尚未弄清，仍需進一步研究。

脂肪增加昆蟲耐寒性的方式有3種：(1)脂肪是昆蟲體內(nèi)重要的儲能物質(zhì)，為昆蟲抵御寒冷以及維持正常生命活動提供能量基礎(chǔ)[27]；(2)脂肪的積累可以增加昆蟲體內(nèi)結(jié)合水的含量，從而降低自由水的含量，降低昆蟲過冷卻點[16,28]；(3)脂肪是昆蟲體內(nèi)重要的代謝物，可為昆蟲合成抗凍劑，如甘油，提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，脂肪對于昆蟲耐寒性的提高有著非常重要的作用。有關(guān)脂肪與昆蟲耐寒性的的研究已經(jīng)在許多昆蟲中有過報道[29-32]。在蒲氏鉤蝠蛾中也發(fā)現(xiàn)寒冷季節(jié)全蟲總脂保持較高水平[33]。因而，在本研究中，冬季蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的脂肪含量顯著升高。

寒冷刺激會增加生物能量的貯備，如冷刺激下的黑腹果蠅，能量的貯備與寒冷耐受性的提高有著直接的聯(lián)系，寒冷季節(jié)蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中能量值升高，對其寒冷耐受性的提高有極大地幫助，保證了低溫下能量的供應(yīng)[34-35]。

與其它昆蟲不同的是，在蒲氏鉤蝠蛾體內(nèi)甘油的含量與溫度并未顯示出密切的相關(guān)性(r=0.283，P=0.370)。甘油是一種重要的小分子耐寒性生化物質(zhì)，也是越冬昆蟲中最普遍的抗凍保護劑[36]。越冬期的松毛蟲[1]、松阿扁葉蜂幼蟲[22]、二化螟幼蟲[37]和桑螟[38]體內(nèi)甘油含量都上升了，Ishigur等[39]和Izumi等[40]均報道了日本境內(nèi)水稻二化螟越冬幼蟲通過提高蟲體甘油含量來降低其冰點和SCP 來增強耐寒性。然而，氣溫降低，蒲氏鉤蝠蛾血淋巴中甘油不升反降。推測在蒲氏鉤蝠蛾體內(nèi)，甘油的作用并不是主要作為抗凍保護劑，而是參與體內(nèi)脂肪代謝。因此甘油在蒲氏鉤蝠蛾中的作有待進一步的證實，有待全蟲體甘油含量的測定。類似的現(xiàn)象也存在于低溫處理下的黃地老虎，在其體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)甘油的積累，表明不同生物體內(nèi)甘油在耐寒性中的作用并不相同，生理調(diào)節(jié)也不盡相同[4]。

此外，昆蟲體內(nèi)含水量對其耐寒性具有極重要的影響[41]。昆蟲會通過降低總含水量、增加結(jié)合水及減少自由水含量等方式增加體液溶質(zhì)濃度，降低體液過冷卻點和冰點，從而提高對低溫的耐受性。大量報道指出在越冬期昆蟲體內(nèi)含水量顯著下降，如異色瓢蟲雌雄成蟲體內(nèi)含水量在9月份達到最大值，隨后逐步降低，越冬后期達到最低值[42]；而在光滑鱉甲中，結(jié)合水含量在最冷的3月份占總含水量的91.5%，7月份逐漸下降至72.1%，而自由水在3月份含量最低，為8.5%[43]。在昆蟲體內(nèi)，水分調(diào)節(jié)主要依賴于蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等3類物質(zhì)，它們通過體內(nèi)新陳代謝過程直接或間接地參與水分代謝過程。本文研究材料為血淋巴，因而未能對個體含水量進行分析，在今后的實驗過程中進一步補充，將有助于其耐寒性機理的探討。

綜上所述，血淋巴中蛋白質(zhì)、總糖以及脂肪等物質(zhì)對于蒲氏鉤蝠蛾耐寒性有著非常重要的作用，幼蟲通過積累3類物質(zhì)，增加血淋巴能量值，以抵御青藏高原的高寒氣候；可能由于生境的不同，甘油在蒲氏鉤蝠蛾中的作用與其它昆蟲存在明顯的有差異，其在耐寒性提高中的功能尚需進一步研究。這為了解蒲氏鉤蝠蛾的強耐寒性以及適應(yīng)高寒環(huán)境的生理生化機制提供理論依據(jù)，豐富了逆境生物學(xué)理論。

[1] 韓瑞東, 孫緒艮, 許永玉, 張光衛(wèi). 赤松毛蟲越冬幼蟲生化物質(zhì)變化與抗寒性的關(guān)系. 生態(tài)學(xué)報, 2005, 25(6): 1352-1356.

[2] Holden C P, Storey K B. Purification and characterization of aldolase from the cold hardy insectEpiblemascudderiana: enzyme role in ghycerol biosynthesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1994, 24(3): 265-270.

[3] 孫緒艮, 郭慧玲, 李恕廷, 王興華. 桑尺蠖越冬幼蟲的耐寒性研究. 蠶業(yè)科學(xué), 2000, 26(1): 129-133.

[4] 黃國洋, 王蔭長, 尤子平. 黃地老虎耐寒機理初探. 浙江林學(xué)院學(xué)報, 1990, 7(2): 140-146.

[5] 尹定華, 傅善全, 李泉森. 貢嘎蝠蛾幼蟲生物學(xué)特性的觀察. 昆蟲知識, 1995, 32(5): 289-291.

[6] 楊大榮, 李朝達, 舒暢, 楊躍雄. 中國蝠蛾屬昆蟲的種類和地理分布研究. 昆蟲學(xué)報, 1996, 39(4): 413-422.

[7] 楊大榮, 沈發(fā)榮, 楊躍雄, 龍勇誠, 魯自, 春生, 斯那都吉, 喻潤清. 蟲草蝠蛾生態(tài)學(xué)的研究Ⅲ. 幼蟲越冬與生理調(diào)節(jié). 動物學(xué)研究, 1988, 9(增刊): 43-49.

[8] 楊大榮, 楊躍雄, 沈發(fā)榮, 魯自. 白馬蝠蛾幼蟲的抗寒性研究. 昆蟲學(xué)報, 1991, 34(1): 32-37.

[9] 張古忍, 古德祥, 劉昕. 中國蝠蛾屬一新種(鱗翅目, 蝙蝠蛾科). 動物分類學(xué)報, 2007, 32(2): 473-476.

[10] 馮慧. 昆蟲生物化學(xué)分析法. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1989: 8-15.

[11] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[12] Nakamatsu Y, Tanaka T. Venom of ectoparasitoid,Euplectrussp. nearplathypenae(Hymenoptera: Eulophidae) regulates the physiological state ofPseudaletiaseparata(Lepidoptera: Noctuidae) host as a food resource. Journal of Insect Physiology, 2003, 49(2): 149-159.

[13] Graney R L, Giesy J P Jr. Effects of long-term exposure to pentachlorophenol on the free amino acids pool and energy reserves of the freshwater amphipodGammaruspseudolimnaeusBousfied (Crustacea, Amphipoda). Ecotoxicology and Environmental Safety, 1986, 12(3): 233-251.

[14] Storey K B, Storey J M. Freeze tolerance in animals. Physiological Reviews, 1998, 68: 27-84.

[15] Storey K B, Storey J M. Biochemistry of cryoprotectants. Insects at low temperature. US: Springer, 1991: 64-93.

[16] 常志光, 高洪學(xué), 葛英, 于殿華, 常帥. 越冬意蜂體內(nèi)水分、蛋白質(zhì)、脂肪的變化與抗寒性的關(guān)系. 中國蜂業(yè), 2007, 58(2): 17-17.

[17] 常志光, 李志勇, 高壽增, 王海生. 卡尼鄂拉蜂越冬期體內(nèi)水分、蛋白質(zhì)、脂肪的變化與抗寒性的關(guān)系研究. 蜜蜂雜志, 2008, (1): 6-7.

[18] Meister K, Ebbinghaus S, Xu Y, Duman J G, DeVries A, Gruebele M, Leitner D M, Havenith M. Long-range protein-water dynamics in hyperactive insect antifreeze proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(5): 1617-1622.

[19] 鐘文英, 普雄明. 熱休克蛋白的分子生物學(xué)研究進展. 醫(yī)學(xué)綜述, 2005, 11(2): 148-150.

[20] Zou Z W, Sun Z X, Li J F, Zhang G R. Molecular cloning and characterization of two heat shock proteins inThitarodespui(Lepidoptera: Hepialidae). CryoLetters, 2011, 32(3): 225-239.

[21] 李慶, 王思忠, 封傳紅, 張敏, 蔣凡, 楊剛, 羅林明. 西藏飛蝗Locustamigratoriatibetensis(Chen)耐寒性理化指標(biāo). 生態(tài)學(xué)報, 2008, 28(3): 1314-1320.

[22] 梁中貴, 張衛(wèi)光, 劉學(xué)輝, 孟慶英, 孫緒艮. 松阿扁葉蜂越冬幼蟲體內(nèi)抗寒物質(zhì)分析. 昆蟲知識, 2005, 42(6): 695-699.

[23] Iordachescu M, Imai R. Trehalose biosynthesis in response to abiotic stresses. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(10): 1223-1229.

[24] Nomura M, Ishikawa Y. Dynamic changes in cold hardiness, high-temperature tolerance and trehalose content in the onion maggot,Deliaantiqua(Diptera: Anthomyiidae), associated with the summer and winter diapause. Applied Entomology and Zoology, 2001, 36(4): 443-449.

[25] Rojas R R, Charlet L D, Leopold R A. Biochemistry and physiology of overwintering in the mature larva of the red sunflower seed weevil,SmicronyxfulvusLeConte (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Insect Physiology, 1991, 37(7): 489-496.

[26] Rojas R R, Charlet L D, Leopold R A. Biochemistry and physiology of overwintering in the mature larva of the sunflower stem weevil,Cylindrocopturusadspersus(Coleoptera: Curculionidae) in the Northern Great Plains. Journal of Insect Physiology, 1994, 40(3): 201-205.

[27] Canavoso L E, Jouni Z E, Karnas K J, Pennington J E, Wells M A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition, 2001, 21(1): 23-46.

[28] 張瑞, 馬紀(jì). 昆蟲過冷卻點的影響因素概述. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 19(11): 76-84.

[29] Bemani M, Izadi H, Mahdian K, Khani A, Amin S M. Study on the physiology of diapause, cold hardiness and supercooling point of overwintering pupae of the pistachio fruit hull borer,Arimaniacomaroffi. Journal of insect physiology, 2012, 58(7): 897-902.

[30] Behroozi E, Izadi H, Samih M A, Moharamipour S. Physiological strategy in overwintering larvae of pistachio white leaf borer,OcneriaterebinthinaStrg. (Lepidoptera: Lymantriidae) in Rafsanjan, Iran. Italian Journal of Zoology, 2012, 79(1): 44-49.

[31] Lehmann P, Lyytinen A, Sinisalo T, Lindstr?m L. Population dependent effects of photoperiod on diapause related physiological traits in an invasive beetle (Leptinotarsadecemlineata). Journal of Insect Physiology, 2012, 58(8): 1146-1158.

[32] Rousseau J, Bauce é, Lavallée R, Guertin C. Winter mortality and supercooling point of the spruce beetle (Coleoptera: Curculionidae) not affected by host tree vigor in Nova Scotia, Canada. Journal of the Acadian Entomological Society, 2012, 8: 1-10.

[33] 鄒志文. 西藏色季拉山鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲研究 [D]. 廣州: 中山大學(xué), 2009: 67-80.

[34] Misener S R, Chen C P, Walker V K. Cold tolerance and proline metabolic gene expression inDrosophilamelanogaster. Journal of Insect Physiology, 2001, 47(4/5): 393-400.

[35] Chen C P, Walker V K. Cold-shock and chilling tolerance inDrosophila. Journal of Insect Physiology, 1994, 40(8): 661-669.

[36] Li N G. Relationships between cold hardiness, and ice nucleating activity, glycerol and protein contents in the hemolymph of caterpillars,AporiacrataegiL.. CryoLetters, 2012, 33(2): 135-143.

[37] 陳永杰, 孫緒艮, 張衛(wèi)光, 牟志剛, 郭光志. 桑螟越冬幼蟲體內(nèi)水分、脂肪、甘油的變化與抗寒性的關(guān)系. 蠶業(yè)科學(xué). 2005, 31(1): 22-25.

[38] 強承魁, 杜予州, 于玲雅, 崔亞東, 陸明星, 鄭福山. 水稻二化螟越冬幼蟲耐寒性物質(zhì)的動態(tài)變化. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2008, 19(3): 599-605.

[39] Ishiguro S, Li Y P, Nakano K, Tsumuki H, Goto M. Seasonal changes in glycerol content and cold hardiness in two ecotypes of the rice stem borer,Chilosuppressalis, exposed to the environment in the Shonai district, Japan. Journal of Insect Physiology, 2007, 53(4):392-397.

[40] Izumi Y, Katagiri C, Sonoda S, Tsumuki H. Seasonal changes of phospholipids in last instar larvae of rice stem borerChilosuppressalisWalker (Lepidoptera: Pyralidae). Entomological Science, 2009, 12(4): 376-381.

[41] 馮宇倩, 王錦林, 宗世祥. 昆蟲越冬蟲態(tài)及耐寒策略概述. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2014, 30(9): 22-25.

[42] 趙靜, 于令媛, 李敏, 鄭方強, 張帆, 許永玉. 異色瓢蟲成蟲耐寒能力的季節(jié)性變化. 昆蟲學(xué)報, 2008, 51(12): 1271-1278.

[43] 馬延龍, 候鳳, 馬紀(jì). 荒漠昆蟲光滑鱉甲的耐寒性季節(jié)變化及其生理機制. 昆蟲學(xué)報, 2009, 52(4): 372-379.

Relationship between hemolymph composition and cold tolerance inThitarodespuilarvae

YI Jiequn1, ZHANG Guren2, GUO Chenlin1, MIN Qiang1, ZOU Zhiwen1,*

1SchoolofLifeSciences,NanchangUniversity,Nanchang330031,China2StateKeyLaboratoryforBiocontrol&InstituteofEntomology,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510275,China

Temperature, particularly extreme cold, is a key stressor that limits the distribution and abundance of insects. In response, various cold adaptations have evolved among insects, such as the accumulations of proteins and lipids, as well as low-molecular-weight cryoprotectants.Thitarodespuiis important as the host ofOphiocordycepssinensis(Berk.) (G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones and Spatafora) and has a limited distribution on Segrila Mountain in Nyingchi of the Tibetan Plateau. Low temperature is the main environmental stressor forT.pui, and although it is able to survive extreme cold, the mechanism is unclear. To determine the mechanism of cold adaptation, the composition of larvae hemolymph and soil temperature was investigated over 1 year (from April 2008 to March 2009) inT.puihabitats. Soil temperature exhibited a single curve, which peaked in August 2008 (11.31℃) and reached the lowest temperature in February 2009 (-0.05℃). The temperature of soil gradually increased from February to August and then decreased until the following February. To determine the factors involved in adaptation to low temperatures, the major components of hemolymph inT.puilarvae were isolated and classified as protein, total sugar, fat or glycerol. The correlation analysis between the components in hemolymph and soil temperature demonstrated that protein, total sugar and fat content fluctuated in response to the change in temperature during the study period. Among these components, proteins were most abundant in hemolymph and were present at the lowest level in September (8.37 mg/mL) and the highest in January (74.2 mg/mL). In spite of the slight decrease in November (32.41 mg/mL) and slight increase in June (34.44 mg/mL), protein levels gradually increased from September to January and decreased between February and August. There was a highly significant negative correlation with soil temperature, described by the functiony=59.238-3.686x(r=-0.789,P=0.002). The second major component was total sugars (12.65—36.12 mg/mL), which remained at low levels during the summer and increased during the winter. There was a significant decrease between April and August, during which the soil temperature increased. The soil temperature remained low from December to February and the total sugar remained high. The relationship between total sugars and soil temperature wasy=30.437-1.12x(r=-0.760,P=0.004), showing the same correlation as that between soil temperature and proteins. The fat content ranged from 7.7 to 12.46 mg/mL and correlated with soil temperature in the same manner as did the other components in larvae hemolymph, withy=11.413-0.307x(r=-0.924,P=0.000). Thus, the gross caloric value of hemolymph was lower in summer and higher in winter. The significant negative correlation between the gross caloric value and soil temperature is illustrated by the function,y=482.180-22.850x(r=-0.860,P=0.000). It is thought that glycerol is an important cryoprotectant in many insects that can respond quickly to fluctuations in the ambient temperature. Therefore, the present finding that glycerol levels were lower in larvae hemolymph ofT.puiand that there was no significant correlation with soil temperature was surprising. This is in contrast with studies of other insects exposed to low temperature. These results show that it is important to enhance the cold hardiness ofT.puilarvae to permit the accumulation of proteins, total sugar, and fat in hemolymph. However, the role of glycerol in cold resistance requires further study.

Thitarodespui; cold hardiness; hemolymph composition

國家自然科學(xué)基金項目(31160081); 國家科技支撐計劃課題(2011BAI13B06); 江西省教育廳項目(GJJ13104); 南昌市農(nóng)業(yè)支撐計劃第37 (2010); 南昌市對外科技合作與成果轉(zhuǎn)化推廣計劃(2013HZCG010)

2014-01-09;

日期:2014-11-19

10.5846/stxb201401090067

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zouzhiwen@ncu.edu.cn

易杰群, 張古忍, 郭晨林, 閔強, 鄒志文.蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴物質(zhì)與其耐寒性.生態(tài)學(xué)報,2015,35(18):6208-6215.

YI J Q, Zhang G R, Guo C L, Min Q, Zou Z W.Relationship between hemolymph composition and cold tolerance inThitarodespuilarvae.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6208-6215.