飼用蛋白酶體外評(píng)價(jià)方法的建立

■白 燕 高愛琴 梁爭文 鄒林源 張鐵鷹

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

飼用酶制劑在畜禽飼糧中的應(yīng)用十分普遍，產(chǎn)品 種類較多，如何科學(xué)、快捷的對(duì)飼用酶制劑產(chǎn)品進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)愈顯重要。近年來，單胃動(dòng)物的體外消化模擬技術(shù)在飼料營養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)方面已得到廣泛應(yīng)用，其能否直接用于評(píng)價(jià)酶制劑尚存爭議。大多體外消化模擬方法各消化參數(shù)確定以飼料養(yǎng)分體外消化率為參照，黃瑞林等、劉雨田等將體外養(yǎng)分消化率達(dá)到最大時(shí)的參數(shù)作為體外消化方法的最適參數(shù)，Bedford等以食糜黏度降低幅度達(dá)到最大時(shí)的參數(shù)作為最適參數(shù)。雖然這兩種確定最佳消化參數(shù)的方法較為簡便，但用于評(píng)價(jià)飼用酶制劑尚存不足。首先，畜禽對(duì)飼料的消化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，飼料養(yǎng)分消化率受飼料類型、畜禽日齡階段和環(huán)境等多種因素的影響。同時(shí)，飼用酶制劑作為一種蛋白類催化劑，其活性也易受消化道內(nèi)環(huán)境條件（pH值和金屬離子）的影響。因此，如何科學(xué)獲得動(dòng)物真實(shí)的消化道內(nèi)環(huán)境參數(shù)是體外評(píng)價(jià)飼用酶的關(guān)鍵。通過屠宰試驗(yàn)動(dòng)物可直接得到畜禽消化道參數(shù)。張鐵鷹通過屠宰不同日齡肉仔雞得到肉仔雞日齡與消化酶水平、消化時(shí)間、pH值、膽汁水平之間的關(guān)系，由此可以確定任意日齡肉仔雞的體外消化法中的參數(shù)水平。王寧娟、鄭衛(wèi)寬、梅學(xué)文等同樣根據(jù)測定試驗(yàn)畜禽消化道真實(shí)參數(shù)，確定體外消化法中的參數(shù)，通過該方法所得參數(shù)更接近待研究畜禽在特定日齡和生長階段消化道的真實(shí)情況。

目前，利用體外法評(píng)價(jià)飼用酶制劑，其種類主要集中在植酸酶和非淀粉多糖酶等，且檢測指標(biāo)主要以磷、還原糖、總能及營養(yǎng)物質(zhì)的消化率為主，而針對(duì)評(píng)價(jià)蛋白酶制劑的研究相對(duì)較少。另外，簡單、快捷也是衡量體外評(píng)價(jià)方法實(shí)用性的一個(gè)重要方面?，F(xiàn)有體外方法中消化產(chǎn)物分離方式主要有透析、過濾和真空抽濾，這些產(chǎn)物分離方法均需花費(fèi)較長時(shí)間，每批次評(píng)價(jià)樣品數(shù)量較有限。離心處理的方式可以方便、快捷的同時(shí)處理多個(gè)樣品，而該法目前在運(yùn)用時(shí)操作較為隨意，有直接離心處理樣品，有加三氯乙酸處理，也有加磺基水楊酸處理消化產(chǎn)物，究竟哪種處理方式更適合于蛋白酶的評(píng)價(jià)還未見報(bào)道。此外，體外消化體系中抗生素的應(yīng)用也較隨意，究竟是否需要使用抗生素來抑制微生物的生長還需要研究證實(shí)。因此，本文將以31日齡肉仔雞消化道內(nèi)參數(shù)（水分、pH值和消化酶）實(shí)際測定值為基礎(chǔ)，并通過對(duì)體外消化法相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一套適合于評(píng)價(jià)蛋白酶制劑在肉仔雞作用效果的準(zhǔn)確、快捷的一套體外評(píng)價(jià)方法，為簡單快速評(píng)價(jià)飼用蛋白酶制劑提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

采用單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選用240只1日齡艾維茵商品肉仔雞公雛，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。采用3層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)管理和免疫程序按常規(guī)程序進(jìn)行。飼糧參照美國NRC（1994）營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及pH值的測定

各重復(fù)試雞在自由采食和飲水的條件下，于31日齡09：00 、12：00、15：00、18：00分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抓取2只，麻醉，打開腹腔，取嗉囊、肌胃與腺胃、十二指腸內(nèi)的全部食糜，空腸、回腸中間段食糜，將食糜樣品混勻后，用pH計(jì)測定各段pH值后，迅速放入-20℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 消化酶水平的測定

將不同消化道部位的各個(gè)時(shí)間段食糜解凍后，分別充分混勻，準(zhǔn)確稱取15 g（精確至0.000 1 g），按1∶1的比例加入去離子水，置于冰浴中勻漿，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，勻漿15 s，每隔15 s勻漿1次。勻漿后的食糜在4℃、6 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液，分別測定胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性。

胃蛋白酶活定義：1個(gè)胃蛋白酶單位（PE）相當(dāng)于在規(guī)定條件下用以下速度分解血紅蛋白時(shí)所需的酶量：每分鐘生產(chǎn)可溶于三氯乙酸溶于的分解物在佛氏指示劑作用下所產(chǎn)生的吸光度與1 mmol酪氨酸所產(chǎn)生的吸光度相等。

胰蛋白酶活定義：在pH值為7.8，溫度為40℃下，每分鐘分解底物產(chǎn)生0.1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)胰蛋白酶和糜蛋白酶活力單位。

淀粉酶活定義：1個(gè)α-淀粉酶單位相當(dāng)于在40℃和pH值6.9的條件下，從可溶性淀粉中釋放出1 mmol還原物質(zhì)（以麥芽糖計(jì)算）時(shí)所需酶量。

1.2.3 食糜含水量的測定

肉仔雞各段消化道食糜含水量的測定，采用GB/T 6435-2006。鑒于肉仔雞消化道內(nèi)食糜實(shí)際含水量不利于在體外將消化酶與飼料混合均勻，進(jìn)而影響體外養(yǎng)分消化率。特別是小腸段的含水量尤為重要。水分含量過低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)隨消化產(chǎn)物積累抑制飼料養(yǎng)分酶解進(jìn)程。通過對(duì)小腸段食糜含水量（89%、91%、93%、95%和97%）對(duì)粗蛋白體外消化率影響的研究，確定小腸段食糜最適含水量。

1.2.4 體外消化法中樣品重量、粒度與食糜停留時(shí)間的確定

體外消化法評(píng)價(jià)飼用酶制劑時(shí)，樣品重量為1 g、粉碎粒度為過60目篩。31日齡肉仔雞食糜，嗉囊、胃和腸階段內(nèi)停留時(shí)間分別為50、61、163 min。

1.2.5 消化產(chǎn)物分離方式的優(yōu)化

鑒于體外消化法中透析、過濾和抽濾等產(chǎn)物分離方法存在的不足，并針對(duì)評(píng)價(jià)蛋白酶這一特殊的飼料添加劑，本研究將分別就直接離心、三氯乙酸或磺基水楊酸沉淀處理后再離心的消化產(chǎn)物分離方式，對(duì)粗蛋白體外消化率的影響進(jìn)行研究，試驗(yàn)分別用豆粕和玉米做底物，根據(jù)體外消化率變異情況確定適宜的產(chǎn)物分離方法。

體外消化結(jié)束后，經(jīng)過3種產(chǎn)物分離方式，具體操作為：直接8 000 r/min離心處理10 min后測定粗蛋白體外消化率；加5 ml三氯乙酸（20%）沉淀蛋白，靜置10 min，8 000 r/min離心處理10 min后測定；加5 ml磺基水楊酸（20%）沉淀蛋白后，靜置30 min，同樣8 000 r/min離心處理10 min后測定粗蛋白體外消化率。

1.2.6 抗生素使用的確定

體外消化法建立時(shí)，不少學(xué)者為了防止微生物的生長，會(huì)在消化體系加一定量的抗生素，如Saunders等；Liu等；Simbaya；Stein等，但有些學(xué)者并沒有使用抗生素，如李偉；Narasimha等；劉東霞等。為了研究本體外法是否需要加抗生素，本試驗(yàn)將在實(shí)際消化時(shí)間（163 min）的基礎(chǔ)上以2 h為間隔延長腸段消化時(shí)間，消化結(jié)束后，用磺基水楊酸沉淀蛋白，離心取上清液，通過平板菌落計(jì)數(shù)法研究體外法中微生物的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA過程進(jìn)行單因子方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 31日齡肉仔雞消化道各段pH值（見表2）

表2 31日齡肉仔雞消化道各段pH值

表2可見，體外消化法的嗉囊、胃和小腸階段pH值水平可以分別設(shè)定為：4.91、3.37、6.20。

2.2 31日齡肉仔雞消化道食糜中各消化酶水平的測定

表3 31日齡肉仔雞消化道中的各酶活水平

由表3可見，31日齡肉仔雞肌胃和腺胃內(nèi)胃蛋白酶水平為0.56 U/g食糜鮮重；十二指腸、空腸和回腸中胰蛋白酶分別為0.31、10.21、9.81 U/g食糜鮮重，糜蛋白酶分別為0.065、0.76、0.34 U/g食糜鮮重，淀粉酶活性分別為 971.86、2 381.36、1 041.28 U/g食糜鮮重?？漳c胰蛋白酶活性較回腸高（P＞0.05），極顯著高于十二指腸（P＜0.01）。糜蛋白酶和淀粉酶活性均是空腸內(nèi)最高（P＜0.05）。

2.3 31日齡肉仔雞消化道各段食糜含水量的確定

表4 31日齡肉仔雞嗉囊、胃和腸段食糜的含水量（%）

由表4可見，31日齡肉仔雞嗉囊、胃（肌胃和腺胃食糜）和空腸食糜含水量分別為62.26%，、67.70%和83.72%。

表5 小腸階段不同含水量對(duì)豆粕粗蛋白體外消化率的影響(%)

由表5可見，粗蛋白體外消化率隨腸段含水量的增加而提高，含水量為97%較其它組差異顯著（P＜0.05），含水量為95%較含水量低的91%、89%組差異顯著（P＜0.05），含水量為93%組較含水量為89%組差異顯著（P＜0.05），兩組低含水量組間差異不顯著（P＞0.05）。可見，腸階段含水量是運(yùn)用體外法評(píng)價(jià)酶制劑時(shí)需要考慮的一個(gè)重要參數(shù)。

2.4 消化產(chǎn)物適宜分離方式的確定

表6 不同消化產(chǎn)物分離方式對(duì)豆粕粗蛋白體外消化率的影響（%）

由表6可知，直接離心、三氯乙酸或磺基水楊酸沉淀處理后再離心三種產(chǎn)物分離方式對(duì)豆粕粗蛋白體外消化率產(chǎn)生一定影響。采用直接離心法豆粕的粗蛋白體外消化率顯著高于沉淀后再離心法（P＜0.05）。經(jīng)三氯乙酸和磺基水楊酸沉淀蛋白后，得到的粗蛋白體外消化率二者間無顯著差異（P＞0.05）。單純從粗蛋白體外消化率來看，直接離心獲得了較高的消化率，變異系數(shù)較小，但直接離心法不能將消化液中的全部蛋白都沉淀，使得在溶液中的小分子蛋白不能經(jīng)離心分離，因此，該法并不科學(xué)。磺基水楊酸沉淀后離心法的變異系數(shù)較小，說明該方法精確度較高，較適合于評(píng)價(jià)作用效果較為微弱的飼用酶制劑產(chǎn)品。

三種消化產(chǎn)物分離方式同樣對(duì)玉米粗蛋白體外消化率有一定影響，見表7。直接離心法得到的粗蛋白體外消化率最高，其次是三氯乙酸沉淀，磺基水楊酸沉淀后得到的體外消化率最低。但三者間差異不顯著（P＞0.05）。由于玉米自身的蛋白含量較低，體外法評(píng)價(jià)玉米粗蛋白體外消化率時(shí)的稱樣量相對(duì)較少，使得測定結(jié)果的變異系數(shù)較大。因此，在用體外法評(píng)價(jià)蛋白酶作用效果時(shí)，不適合用玉米做底物。

表7 不同消化產(chǎn)物分離方式對(duì)玉米粗蛋白體外消化率的影響

2.5 體外消化食糜中的總菌數(shù)觀測（見表8）

表8 腸段不同消化時(shí)間消化液中總菌數(shù)目（個(gè)/ml）

根據(jù)表8試驗(yàn)結(jié)果顯示，體外消化時(shí)消化液中總菌數(shù)隨著消化時(shí)間的升高而增加。腸段消化時(shí)間為31日齡肉仔雞實(shí)際消化時(shí)間163 min時(shí)，玉米和豆粕消化液中的菌數(shù)以高達(dá)1.37E+04個(gè)/ml和1.08E+04個(gè)/ml，隨著消化時(shí)間的延長，菌落數(shù)目迅速增多，當(dāng)消化時(shí)間約20 h時(shí)，菌落數(shù)目已達(dá)到3.68E+06個(gè)/ml和9.37E+07個(gè)/ml。由于細(xì)菌本身含蛋白質(zhì)，當(dāng)菌落數(shù)目較多時(shí)，會(huì)影響對(duì)蛋白酶制劑的評(píng)價(jià)。顯然，體外消化時(shí)抗生素的運(yùn)用十分必要。

3 討論

3.1 消化酶水平對(duì)體外消化的影響

31日齡肉仔雞肌胃和腺胃內(nèi)胃蛋白酶水平為0.56 U/g食糜鮮重，較張鐵鷹的測定值偏低，這可能與試驗(yàn)日糧的不同有關(guān)。31日齡肉仔雞胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶3種酶活性在十二指腸、空腸和回腸均是空腸內(nèi)最高，這與張鐵鷹測定的35日齡肉仔雞結(jié)果相一致。劉雨田測定飼喂玉米-豆粕型和玉米-豆粕-棉粕型飼糧蛋雞十二指腸和空腸酶活時(shí)，胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性均是空腸高于十二指腸，僅有玉米-豆粕-棉粕型飼糧的糜蛋白酶水平是十二指腸高于回腸。可見，飼糧類型可能是影響到消化道酶活水平的主要因素之一。由于食糜在十二指腸內(nèi)的停留時(shí)間較短，十二指腸并非食糜營養(yǎng)成分消化吸收的主要場所。鑒于空腸內(nèi)消化酶活性最高，食糜在其中的停留時(shí)間最長，因此，空腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場所。在體外消化法中，小腸段的消化參數(shù)主要參考空腸的消化參數(shù)。因此，本試驗(yàn)將31日齡肉仔雞體外消化法小腸段胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性水平分別采用肉仔雞空腸的實(shí)測值，分別為10.21、0.76和2 381.36 U/g食糜鮮重。

3.2 含水量對(duì)體外消化的影響

張鐵鷹、梅學(xué)文建立的體外消化法中含水量是以所研究對(duì)象消化道的實(shí)際含水量來確定的。在本試驗(yàn)中測得31日齡肉仔雞嗉囊和胃內(nèi)實(shí)際含水量均較低（66.1%和67.7%），在體外條件下，食糜無法被完全浸潤，且通過恒溫振搖無法實(shí)現(xiàn)模擬胃腸運(yùn)動(dòng)使胃蛋白酶與食糜混合均勻的物理消化過程，進(jìn)而影響了飼料養(yǎng)分體外消化率。因此，將體外消化法中的嗉囊含水量以恰好能將食糜浸潤，并能通過震搖將食糜充分混勻?yàn)橐恕Ｍㄟ^對(duì)體外消化不同時(shí)間的食糜總好氧菌數(shù)的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，微生物繁殖較快，需要添加抗生素抑制微生物生長。綜合考慮嗉囊消化期水量為：稱取1 g底物，加3.5 ml一定濃度鹽酸溶液（調(diào)節(jié)嗉囊內(nèi)pH值），再加0.5 ml氯霉素液，最終液體占80%。胃內(nèi)食糜含水量則以既能滿足調(diào)節(jié)pH值，又可節(jié)省胃蛋白酶的用量為原則。具體操作為嗉囊消化期結(jié)束后，加0.5 ml一定濃度的鹽酸液（調(diào)節(jié)到胃內(nèi)pH值），再加0.5 ml鹽酸-胃蛋白酶液，最終胃消化期液體占83%。小腸是養(yǎng)分消化和吸收的主要場所，時(shí)間較長，消化產(chǎn)物多。為消除消化產(chǎn)物積累對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用，適度增加小腸段含水量。由本試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)小腸含水量為97%時(shí)，豆粕的粗蛋白消化率最高（P＜0.05）。因此，本體外消化的方法小腸段食糜含水量97%為宜。這與侯曉峰、趙鋒等建立的方法一致。在胃消化結(jié)束后，加1 ml一定濃度的碳酸氫鈉液調(diào)節(jié)空腸段pH，再加26 ml“模擬腸液”，即含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶等消化酶的緩沖液，最終小腸消化期液體占97%。

3.3 產(chǎn)物分離方式對(duì)體外消化的影響

如何界定已消化蛋白和未消化蛋白是利用體外法評(píng)價(jià)飼料蛋白質(zhì)消化率的關(guān)鍵。不同消化產(chǎn)物分離方式，蛋白體外消化率也存在差異。與評(píng)價(jià)飼料蛋白質(zhì)消化率相比，評(píng)價(jià)飼用蛋白酶對(duì)體外法方法的精確度和準(zhǔn)確度要求會(huì)更高，確定科學(xué)的產(chǎn)物分離方式是體外法評(píng)價(jià)飼用蛋白酶的核心。

直接離心法操作簡便、快捷，但其僅將大分子蛋白和未消化的殘?jiān)恋硐聛?，一些未徹底消化小分子蛋白及肽段則無法分離。這往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)體外消化率高于其真實(shí)值。本試驗(yàn)中，直接離心法測得豆粕粗蛋白體外消化率為89.2%，已明顯高于肉仔雞對(duì)豆粕的實(shí)際消化率。這說明直接離心的消化產(chǎn)物分離方式不適宜評(píng)價(jià)蛋白酶。利用磺基水楊酸和三氯乙酸將消化后食糜沉淀后再離心也是一種常用的消化產(chǎn)物分離方式，但二者沉淀蛋白的分子量不同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)磺基水楊酸和三氯乙酸沉淀蛋白后測得豆粕粗蛋白體外消化率無顯著差異（P＞0.05）。這表明二者均可作為體外消化法測定粗蛋白消化率時(shí)的沉淀劑。經(jīng)多次重復(fù)測定發(fā)現(xiàn)，磺基水楊酸較三氯乙酸豆粕粗蛋白體外消化率變異系數(shù)更小。這說明用磺基水楊酸沉淀蛋白法精確度更高，較為適合于評(píng)價(jià)較為靈敏的影響因素。因此，本研究所建立的體外消化法采用磺基水楊酸沉淀后再離心的消化產(chǎn)物分離方式。這與Bioson等的方法一致。

4 結(jié)論

在張鐵鷹和Boisen建立的肉仔雞和豬體外消化方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合本研究所得研究結(jié)果，建立了一套可用評(píng)價(jià)飼用蛋白酶的肉仔雞（31日齡）體外消化模擬方法。具體操作如下，嗉囊消化期：準(zhǔn)確稱取過60目篩的1 g（精確到0.000 1 g）飼料（豆粕等）樣品，置于50 ml離心管中，加3.5 ml適宜濃度鹽酸溶液，加0.5 ml氯霉素（30 μg/ml），將 pH調(diào)至4.91，擰緊蓋子，將離心管水平固定于40℃全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，保證其無傾斜，并不斷振蕩(120次/min)，5 min后開始計(jì)時(shí)，消化50 min。胃消化期：取出離心管，冰浴，加入0.5 ml適宜濃度的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH到3.3，再加入0.5 ml胃蛋白酶鹽酸（0.015 M）溶液，蓋好瓶蓋，混合均勻后（該過程設(shè)定15 min加樣時(shí)間），將離心管固定于40℃的全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，不斷振蕩(120次/min)。放入5 min后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)消化61 min。腸消化期：胃消化結(jié)束后，加1 ml適宜濃度的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值到6.20，再加入26 ml pH值為6.20的“小腸液”（該過程設(shè)定15 min加樣時(shí)間），搖勻，放回40℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，振蕩頻率120次/min。5 min后開始計(jì)時(shí)，消化163 min。消化結(jié)束后，加5 ml磺基水楊酸（20%）沉淀蛋白，靜置30 min后8 000 r/min離心10 min，取上清液用凱氏定氮法測定蛋白含量，計(jì)算粗蛋白體外消化率。