天麻最細粉對帕金森病大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸鳥苷的調(diào)節(jié)作用

劉 瑋 曹燕滔 艾 國

1.空軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100036；2.武警總醫(yī)院干三科，北京 100039；3.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所，北京 100142；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種老年神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，主要的病理特征不僅包括引起核心的運動障礙癥狀的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)變性，而且包括中樞、外周和自主神經(jīng)系統(tǒng)的多靶點侵犯，并伴有廣泛的路易小體和路易軸突的形成，從而引起基底神經(jīng)節(jié)的功能失調(diào)[1]。臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙四大核心癥狀為主要表現(xiàn)，病程呈慢性進展性[2]。 據(jù)統(tǒng)計全球65 歲以上老年人中，有1%的人患有PD，而到了80 歲，患病率將增加5 倍。在我國，PD 的發(fā)病率更高。目前，我國有200 萬PD 患者，且年增10 萬新患者。 該病的治療目前無論藥物或手術(shù)，只能改善其癥狀，不能阻止病情的發(fā)展，更無法治愈，給患者以及全社會都造成十分嚴重的負擔。 對PD 的治療和研究工作刻不容緩。

在PD 發(fā)生發(fā)展過程中，由于中腦多巴胺（dopamine，DA）產(chǎn)生的減少引起全身多部位的神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生紊亂，如去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）。 這些神經(jīng)遞質(zhì)的合成、分泌發(fā)生紊亂，引發(fā)了基底神經(jīng)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控功能失調(diào)，導(dǎo)致運動不能癥狀的出現(xiàn)。在之前的實驗中，筆者采用6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立了PD 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過天麻普通粉和最細粉的治療后，無論是在改善PD 大鼠的神經(jīng)行為學(xué)方面，還是在減輕PD 大鼠氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)炎性反應(yīng)方面，天麻最細粉的治療效果均要優(yōu)于普通粉[3]。為了進一步確證天麻最細粉對于PD 大鼠的治療作用，本文探討了天麻最細粉和普通粉對PD 大鼠學(xué)習記憶能力的改善作用，以及對PD 大鼠腦內(nèi)3 種神經(jīng)遞質(zhì)——DA、NE 和5-HT 的影響。 此外，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monoph-osphate，cGMP）是細胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在細胞代謝及多種生理效應(yīng)的體現(xiàn)中具有關(guān)鍵的作用[4]。 筆者繼而測定了PD 大鼠經(jīng)過天麻最細粉和普通粉治療后血清中cAMP、cGMP 的含量，為天麻最細粉的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

天麻（Gastrodia elata）原產(chǎn)地貴州，普通粉（D50=157.10 μm）和最細粉（D50=27.44 μm）均由四川金歲方藥業(yè)有限公司提供。 兩種粉體的電鏡照片見圖1。

圖1 天麻普通粉（A）和最細粉（B）的掃描電鏡照片（500×）

1.2 動物

健康Wistar 雄性大鼠，體重195～210 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為醫(yī)動字SCXK-（軍）2002-2001。

1.3 試劑與儀器

鹽酸氯胺酮注射液（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，0.1 g/2 mL）；6-OHDA、鹽酸去水嗎啡、DA 鹽酸鹽、NE 鹽酸鹽和5-HT 鹽均購自美國Sigma 公司；大鼠cAMP 酶免試劑盒、大鼠cGMP 酶免試劑盒均由成都光?？萍加邢薰咎峁?；Waters 高效液相色譜儀（Millennium 32 色譜工作站，Waters460 電化學(xué)檢測器，美國Waters 公司）；色譜柱為AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Alltech 公司）；AE163天平（瑞士Mettler 公司）；大鼠腦立體定位儀（軒泰儀北京科技有限公司）；微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠）。

1.4 分組及給藥

PD 模型的制備如前所述[3]。 挑選造模成功的PD大鼠隨機分為模型組、天麻普通粉組（1.8 g/kg）、天麻最細粉組（1.8 g/kg），每組10 只，另納入10 只正常大鼠為正常組。將天麻普通粉和最細粉分別加入適量蒸餾水配制成2 g/mL 的混懸液，臨用現(xiàn)配，搖勻取用灌胃給藥。天麻普通粉和最細粉在造模成功后分別以相應(yīng)的粉體混懸液灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)3 周。正常組和模型組以蒸餾水代替藥材，其他均相同。

連續(xù)給藥3 周后，用Morris 水迷宮測試大鼠的學(xué)習記憶能力。之后，各組大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%烏拉坦溶液（10 mL/kg）麻醉，于枕骨大孔處斷頭處死，腹主動脈取血，制血漿，待測cAMP 和cGMP含量。 在冰皿上迅速分離雙側(cè)腦組織，取腦組織塊0.3～0.4 g，在4℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，電子天平稱重，再加入4℃生理鹽水后勻漿。將勻漿液以4000 r/min 離心15 min。 將上清液置-80℃冰箱中備用，測定腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。

1.5 學(xué)習記憶能力檢測

采用Morris 水迷宮測試其學(xué)習記憶能力。 前4 d為訓(xùn)練時間，第5 天為測試時間。訓(xùn)練每天上午進行，訓(xùn)練5 次，每次間隔15 min，每次將大鼠面向池壁分別從4 個象限的4 個入水點入水，記錄其在60 s 內(nèi)尋找平臺的時間，即逃避潛伏期。 如果達60 s 仍未找到平臺，則引導(dǎo)其到達平臺，停留30 s，本次成績計為60 s，然后進行下次訓(xùn)練。 測試時取消平臺，同法觀察各組大鼠逃避潛伏期[6]。

1.6 腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定

神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測法[7]。取腦組織勻漿，加正丁醇5 mL，混勻，于4℃下離心（5000 r/min）15 min。 取上清液，加HClO4（0.1 mol/L）0.15 mL，正庚烷0.2 mL，旋渦振蕩3 min 后離心（3000 r/min）。除去有機相，在下層的水相中加入1 mL CHCl3，經(jīng)旋渦振蕩3 min、低速離心3 min 后，取水相直接進樣，進樣量20 μL。 流動相為緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸三鈉和0.1 mol/L 磷酸氫二鈉） ∶甲醇=90∶10 的溶液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾并超聲脫氣后使用，流速為1 mL/min。 電化學(xué)監(jiān)測器設(shè)定電壓為+650 mV。 洗脫順序依次為NE、DA、5-HT。

1.7 血清中cAMP 和cGMP 含量的測定

取血漿2 mL，靜置30 min 后，3000 r/min 離心10 min，取上層血清，4℃保存待測。 按酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書操作，即在96 孔板中加入準備好的樣品和對照品，生物素標記二抗和酶標試劑，37℃反應(yīng)60 min，洗板5 次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min，加入終止液。 在酶標儀450 nm 波長下讀測量各孔的吸光度并計算。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習記憶能力比較

正常組、模型組、天麻普通粉組和天麻最細粉組大鼠的逃避潛伏期分別為（14.5±1.1）、（37.4±3.3）、（29.8±3.3）和（23.6±2.2）s。 與正常組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P ＜0.01）。與模型組比較，天麻普通粉組和天麻最細粉組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P ＜0.05），且天麻最細粉組對大鼠學(xué)習記憶能力的改善作用優(yōu)于天麻普通粉組（P ＜0.05）。 見圖2。

2.2 各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量比較

圖2 各組大鼠逃避潛伏期比較

模型組大鼠腦組織DA、NE、5-HT 含量均顯著低于正常組大鼠（P ＜0.01）；經(jīng)治療后，天麻普通粉組和天麻最細粉組的DA、NE、5-HT 含量均有所增加，且天麻最細粉組的改善作用優(yōu)于天麻普通粉組（P ＜0.05）。 見表1。

表1 各組PD 大鼠腦組織內(nèi)多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺含量比較（ng/g，±s）

表1 各組PD 大鼠腦組織內(nèi)多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺含量比較（ng/g，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，aP ＜0.05；與天麻普通粉組比較，bP ＜0.05；DA：多巴胺；NE：去甲腎上腺素；5-HT：5-羥色胺

組別 只數(shù) DA NE 5-HT正常組模型組天麻普通粉組天麻最細粉組10 10 10 10 413.3±22.3 278.8±18.9*345.2±12.9a 388.9±15.8ab 345.6±14.8 237.9±12.1*266.8±14.7a 298.8±17.5ab 223.6±11.7 138.7±9.5*162.3±12.0a 189.9±14.5ab

2.3 各組大鼠血清中cAMP 和cGMP 含量比較

較之正常組，模型組cAMP 顯著下降，cGMP 顯著升高，cAMP/cGMP 值顯著降低（P ＜0.01）。 經(jīng)過天麻普通粉和最細粉的3 周治療后， 較之PD 模型大鼠，大鼠血清中的cAMP 顯著上升（P ＜0.05），cGMP 顯著降低（P ＜0.05），進而二者的比值顯著升高（P ＜0.05），趨于正常，而且天麻最細粉的療效明顯優(yōu)于天麻普通粉（P ＜0.05）。 見表2。

表2 各組PD 大鼠腦血清中的環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷含量及環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸鳥苷比較（±s）

表2 各組PD 大鼠腦血清中的環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷含量及環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸鳥苷比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，aP ＜0.05；與天麻普通粉組比較，bP ＜0.05；cAMP：環(huán)磷酸腺苷；cGMP：環(huán)磷酸鳥苷

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3 討論

PD 多發(fā)于中老年人，男性略多于女性，是中老年人致殘的主要原因之一。 其發(fā)病機制迄今尚不十分清楚，可能與環(huán)境因素、免疫學(xué)異常、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激過度、年齡老化、細胞凋亡等諸多因素有關(guān)，是多種機制協(xié)同作用的結(jié)果。 隨著人口老齡化的加劇和人們生活節(jié)奏的增快，以PD 為代表的中樞神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為僅次于心血管疾病、惡性腫瘤以及中風之后的主要致死性疾病，該病的治療是神經(jīng)內(nèi)科面臨的世界性難題。

目前尚無治療PD 的特效藥物，常用西藥只能控制癥狀，以左旋多巴為代表的藥物替代療法仍是西醫(yī)治療帕金森病的金標準，但是隨著用藥時間的延長和用量的加大，毒副作用也越來越大，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。 中醫(yī)中藥以其毒副作用小、協(xié)同作用強和整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢，為PD 的中藥防治提供了良好前景?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明，在保護神經(jīng)細胞、抑制氧化應(yīng)激、抗興奮性毒性、抑制細胞凋亡等方面，中醫(yī)藥的作用明顯。 進一步深入挖掘中醫(yī)中藥的潛力，對于提高PD 患者的生存質(zhì)量意義重大[8]。 有多種中藥復(fù)方、單味藥、有效部位及單體均可在動物模型上對PD有防治作用，其主要機制涉及保護黑質(zhì)細胞、改善神經(jīng)遞質(zhì)含量、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫、提高化療療效、減輕毒副作用等，并可能延緩疾病進程。 尤其是中藥復(fù)方通過多種有效成分對人體有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的整合調(diào)節(jié)作用，可能對PD 神經(jīng)保護治療有一定的優(yōu)勢[9]。

天麻為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata）的干燥塊莖，又名赤箭、定風草、獨搖蘭，為我國傳統(tǒng)名貴中藥，主治頭昏、眩暈、肢體麻木、抽搐、中風等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。 從天麻干燥塊莖中提取出的化學(xué)成份主要有酚類、有機酸類及植物中常見的甾醇等，其中活性成分含量最高的有效單體成分是天麻素，又稱天麻苷，常作為衡量天麻藥材和制劑質(zhì)量的指標成分。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實，天麻具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗感染等作用，并對大腦的學(xué)習和保護功能也有不同程度的作用[10]。 實驗證實，天麻對PD 模型大鼠具有DA 神經(jīng)元保護作用，能夠改善PD 大鼠的運動功能，恢復(fù)紋狀體的DA 含量，減緩PD 病程的進展[11-13]。 作為常用中藥，天麻經(jīng)常出現(xiàn)在中醫(yī)治療PD 的方藥之中[14]。

采用超微粉碎的方式可以將中藥粉碎成最細粉。由于超微粉碎減少了細胞壁的屏障作用，因而比表面積大幅提高，改善了口感，減少了藥材用量，可以大幅提高細胞內(nèi)有效成分的釋放速度及釋放量，顯著提高中藥的生物利用度[15]。 在前期的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)天麻經(jīng)過超微粉碎后，隨著粒徑的減小（D50由157.10 μm減小到27.44 μm），中藥粉體的比表面積顯著增加（由0.403 m2/g 增加到0.626 m2/g），中藥粉體的醇溶性浸出物和有效成分的提取效率也顯著改善，天麻醇溶性浸出物的量由普通粉的10.83%提高到最細粉的12.23%，天麻有效成分（天麻素）的量由普通粉的0.31%提高到最細粉的0.43%[16]。 在隨后的常溫留樣實驗考察中，比較了不同時間的天麻最細粉的形貌結(jié)構(gòu)、粒徑、比表面積、堆密度、休止角等粉體學(xué)特征以及有效成分（天麻素）的量和體外溶出曲線的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12 個月的常溫留樣實驗，天麻最細粉的粉體學(xué)特征沒有發(fā)生顯著性改變，有效成分（天麻素）的量基本保持不變，體外溶出曲線的差異性很小，具有等價性，表明天麻制成最細粉后，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，可以保證臨床用藥的安全[17]。 動物實驗研究亦肯定了天麻在制成最細粉后，藥理效應(yīng)顯著增強[3]。

PD 動物模型的制作是PD 研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。在眾多的模型中，6-OHDA 大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）靈長類模型的病理改變以及行為學(xué)表現(xiàn)與人類PD 表現(xiàn)相類似，成為目前最常用最經(jīng)典的PD 動物模型，對研究PD 主要病理機制和治療藥物起著重要作用[18]。 在之前研究[3]的基礎(chǔ)上，筆者繼續(xù)采用經(jīng)典的6-OHDA 損毀注射法制作PD 大鼠模型，天麻普通粉和最細粉分別給藥3 周后，用Morris 水迷宮測試天麻對PD 模型大鼠學(xué)習記憶能力的影響；采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測法檢測腦內(nèi)DA、NE 和5-HT 神經(jīng)遞質(zhì)的含量；采用酶聯(lián)免疫法測定經(jīng)過天麻普通粉和最細粉治療后，PD 模型大鼠血清中cAMP、cGMP 及cAMP/cGMP 比值的變化。 實驗結(jié)果表明，在改善PD 大鼠的學(xué)習記憶能力、提高PD 大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)的水平、調(diào)節(jié)血清中cAMP/cGMP 的平衡方面，天麻具有確實的功效，而且天麻最細粉的效果要優(yōu)于普通粉，再次為天麻最細粉的臨床使用提供了科學(xué)依據(jù)。

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