干細胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Oct4在肺癌患者中的表達及臨床意義

項保利 李琳琳 曹 亮 陳麗萍

1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院急診科，河北張家口 075000

惡性腫瘤已成為當今危害人類生命的頭號殺手， 全世界每年惡性腫瘤的致死人數(shù)超過1000 萬人，死亡率列居疾病之首[1]。在各種類型的惡性腫瘤中，肺癌對人類的危害尤為顯著，據(jù)統(tǒng)計近20 年肺癌的死亡率已位居腫瘤首位，對人類的健康和生存構(gòu)成重大威脅[2]。隨著研究的逐漸深入，越來越多的證據(jù)證明多種惡性腫瘤皆由一種具有自我更新能力的細胞誘導產(chǎn)生，這種細胞被稱為“腫瘤干細胞”，這給惡性腫瘤的治療提供了新的方向，人們期望以腫瘤干細胞為靶向治療方法能夠有效根除腫瘤，改善患者預后。Sox2、Oct4 是其中具有代表性的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子，兩者的突變和異常表達與許多體內(nèi)腫瘤有關[3]。 Oct4 是轉(zhuǎn)錄因子POU 家族中具有代表性的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細胞、成人組織的祖細胞、胚胎生殖細胞、原發(fā)腫瘤、胚胎和生殖腫瘤細胞中表達。研究人員實驗發(fā)現(xiàn)，該基因只表達于腫瘤細胞中，在正常的體細胞中則表達缺失，很自然地傾向于Oct4在腫瘤形成中發(fā)揮關鍵作用。 Sox2 是性別決定區(qū)因子，是遺傳特性及保持膠質(zhì)瘤祖細胞增殖的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于各類腫瘤中。 這兩個基因共同參與基因調(diào)控網(wǎng)路，在胚胎形成和胚胎干細胞的多分化潛能及自我更新能力中發(fā)揮著重要作用。這些基因特異性的表達不在體細胞中，而在于人類生命周期的階段中，因此對癌癥治療的潛力巨大。 近年來國內(nèi)外研究對象多為細胞系，且研究方向主要為調(diào)節(jié)基因表達能力方面，對實體瘤方面的研究較少。 近年來各類研究成果指出，這兩種因子在部分典型的腫瘤細胞系中有一定表達，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 但關于在肺癌組織中是否有兩種因子的表達及是否參與疾病進展與預后的各類問題目前尚無詳細報道。本研究采用免疫組化生物學實驗技術(shù)，檢測肺癌組織中Sox2、Oct4的表達情況，并比較在各類型癌組織中兩種因子表達水平的差異，分析其與肺癌的病理類型、臨床分期、分化程度及其發(fā)生發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年1 月～2013 年12 月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的肺癌患者60 例，所有患者均經(jīng)病理檢查確診。 其中男38 例，女22 例，年齡34～72 歲，平均（53.9±19.2）歲。依據(jù)2004 年WHO 制訂的肺癌分類標準進行病理分型及分期，60 例患者中鱗癌30 例、腺癌20 例、小細胞癌5 例和大細胞癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期9 例。所有患者均為首次發(fā)病且術(shù)前未進行化療、放療及免疫治療。 另取我院同期經(jīng)肺部手術(shù)切除并蠟塊存檔的正常肺組織20 例作為對照，均來自我院行健康檢查且診斷結(jié)果為正常的健康者。包括男12 例，女8 例；年齡35～71 歲，平均（53.2±19.1）歲。 所有研究對象均為自愿參與并簽署知情同意書，兩組性別、年齡一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化檢測Oct4、Sox2 的表達

用4%多聚甲醛的固定組織標本，常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)脫蠟，用水浴法修復抗原，用3%的雙氧水抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉內(nèi)源性非特異性抗原，加入Oct4、Sox2 多克隆抗體，4℃下過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色反應，用蘇木精復染封片。 所用抗體均購自Abcam 公司，二抗試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判讀及評分標準

光鏡下進行觀測，陽性反應：細胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)有棕黃色、黃色或褐色顆粒。 依據(jù)查看到的陽性細胞所占比例及染色深淺評定陽性反應的強度。觀察時按照視野中陽性細胞所占比例進行評分：百分比≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，在＞75%以上者為4 分。按照染色強度進行評分：不著色為0 分；淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。 最后按兩種評分乘積分成陰性：0～2 分；陽性：3～12 分[4-6]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Sox2、Oct4 在肺癌組織及正常肺組織中的表達情況

Sox2、Oct4 在20 例正常肺組織中表達均為陰性，在60 例肺癌組織中，Sox2 陽性28 例，陽性表達率為46.7%；Oct4 陽性43 例，陽性表達率為71.7%。 與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.924，11.377；均P ＜0.05）。

2.2 肺癌組織中Sox2、Oct4 的表達與臨床病理參數(shù)的關系

病理分期、病理類型與分化程度不同的肺癌組織中Sox2、Oct4 的陽性表達率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；而不同年齡、性別的肺癌組織中Sox2、Oct4 的陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

2.3 肺癌組織中Sox2 與Oct4 表達的關系

Sox2 與Oct4 在肺癌組織中的陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。 見表2。

3 討論

腫瘤的發(fā)生與很多原因有關，目前認為，惡性腫瘤是一種干細胞疾病，源自組織成體干細胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究證明[7]，腫瘤細胞與未分化的胚胎細胞都具無限增殖的能力、自我更新以及侵襲性，因此二者之間存在某些相似性，提示了在腫瘤細胞中也可能會出現(xiàn)某些胚胎干細胞因子。肺癌是當今世界上對人類生命健康威脅最大的惡性腫瘤，其具有較高的發(fā)病率及死亡率，目前對疾病發(fā)生發(fā)展的探索并尋求有效的治療方法是醫(yī)學界關注的熱點。 腫瘤干細胞理論指出，腫瘤中存在一小群腫瘤的啟動細胞，它們所具備的自我更新及抵抗治療等特點是腫瘤治愈率低、治療復雜且復發(fā)性高的根源。近年來人們對干細胞的研究較為深入，越來越多學者經(jīng)研究證實了腫瘤起源于干細胞這一觀點[8]。多數(shù)學者指出，干細胞的分子印跡決定著腫瘤的預后[9]。Oct4 與Sox2 是早期胚胎發(fā)育及細胞特征維持所必須的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及消化道器官發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。 另外，這兩種因子還參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)等各類腫瘤的發(fā)展過程當中。 它們在維持、調(diào)節(jié)腫瘤干細胞自我更新、侵襲力等特性方面均發(fā)揮著重要作用并逐漸成為研究腫瘤干細胞作用機制和防治的直接通道。為進一步支持這些理論，研究人員對腫瘤干細胞進行了Sox2 與Oct4 基因的敲除。結(jié)果顯示，這些腫瘤啟動細胞在去除二者后失去了自我更新、無限增殖及形成腫瘤的能力，最終導致腫瘤細胞的凋亡。 兩者的突變和異常表達與許多腫瘤有關。這些基因表達的特異性與病理類型、臨床分期、分化程度及其與肺癌發(fā)生發(fā)展的關系都需要進行進一步研究，其結(jié)果對肺癌的早期診斷及治療有巨大的臨床意義[10]。

表1 肺癌組織中Sox2、Oct4 的表達與臨床病理參數(shù)的關系（n=60，例）

表2 肺癌組織中Sox2 與Oct4 表達的關系（n = 60，例）

Sox 基因家庭最早發(fā)現(xiàn)于小鼠體內(nèi)，隨后在鳥類、魚類、哺乳類以及人類等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量該家族的基因片段。根據(jù)染色體的組成和基因序列的相似性可以將其分為10 個亞群。在早期胚胎的形成與發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、性別形成、腫瘤發(fā)生等重要生物學過程中，所編碼的蛋白起到不可替代的作用。該基因參與維持胚胎干細胞的多樣性并在各類器官發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，其中包括支氣管的形成。 在腫瘤基因表達的研究中，通過分析分化中激活的基因結(jié)果表明，Sox2 在低分化的腫瘤中高表達，將該因子與Oct4 等轉(zhuǎn)錄因子共同轉(zhuǎn)入成纖維細胞或腫瘤細胞后能夠建立多能分化干細胞或多能分化腫瘤細胞。許多研究指出，Sox2 主要是通過參與調(diào)解復雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡以維持干細胞特性及腫瘤干細胞的抗凋亡特性[11]。因此，靶向Sox2 是治療腫瘤的良好政策。 但盡管許多針對腫瘤組織的研究報道了該因子在前列腺、乳腺癌等方面的高表達且闡明Sox2 的發(fā)生對腫瘤發(fā)生的重要性但該因子在調(diào)控腫瘤發(fā)生的作用機制尚不完全清晰。 研究指出，在人與鼠的體細胞中將該因子與Oct4 等因子轉(zhuǎn)入細胞后可使機體細胞發(fā)生多能干細胞轉(zhuǎn)化。 而該因子與OCT4/NANOG 以及LIN28 這4 個因子的公轉(zhuǎn)，可使人的體細胞發(fā)生多能干細胞化并具有胚胎干細胞的特性[12]。 ESCs 基因Oct4 也稱Oct3/4，位于染色體的6p21.31 位置。該因子屬于Ⅴ類POU 轉(zhuǎn)錄因子家族，由Pou5fl 基因碼產(chǎn)生，最初發(fā)現(xiàn)于胚胎腫瘤細胞。后來發(fā)現(xiàn)該因子的表達嚴格局限于小鼠生命周期全程或多功能細胞中。 它與Sox2 等轉(zhuǎn)錄因子能對胚胎干細胞進行自我更新并保持胚胎干細胞的多潛能性，是生殖細胞和胚胎干細胞的標志物[13]。 目前可以確定的是，Oct4 作為公認的胚胎干細胞標志物，在卵母細胞、胚囊的內(nèi)細胞團、早期分裂期胚胎、卵圓柱期胚胎的原始生殖細胞及原始外胚層中均有表達且隨著細胞的不斷分化，其表達水平會逐漸下調(diào)，說明它能夠保持細胞發(fā)育中的多能性。 有研究顯示，Sox2 在消化道腫瘤中表達量高，該表達因子對患者腫瘤組織的存在意義為促進細胞凋亡周期、抑制細胞生長。 而Oct4 最初發(fā)現(xiàn)于胃癌及胃潰瘍等胃部疾病患者病灶組織中，該類患者病灶組織中Oct4 表達量較高，對癌癥表達和預后密切相關，調(diào)控患者治療及預后。 肺癌的發(fā)生起源是一個多因素、多階段的過程，其發(fā)病機制較為復雜。 目前已經(jīng)證明[14]，未分化的胚胎細胞與腫瘤細胞都有自我更新、無限增殖的能力及侵襲性。 近年來各類研究發(fā)現(xiàn)，Oct4 可表達于造血及間充質(zhì)干細胞、胰島、外周血、腸上皮、子宮內(nèi)膜、臍帶血、肺臟、甲狀腺、腎臟及羊水和臍帶血等組織的祖細胞[15-17]。 這些結(jié)果提示，Oct4 可能在胚胎組織、成體干細胞及胚胎癌組織里表達。 目前對該因子的分子調(diào)節(jié)機制研究較少，但部分研究發(fā)現(xiàn)，相對于生殖細胞及胚胎干細胞而言，該因子的表達會隨著細胞的分化而下降[18]。 實驗研究也指出，分化的滋養(yǎng)外胚層細胞比內(nèi)細胞群Oct 表達低30 倍，其表達水平上調(diào)與下調(diào)分別與維持細胞多能性及細胞的分化有關。胚胎干細胞內(nèi)Oct 的水平?jīng)Q定胚胎干細胞3 種不同命運，其表達水平保持在特定水平才能使胚胎干細胞處于不斷自我更新的狀態(tài)[19]。 當它的水平是正常的2 倍時，可分化為中胚層細胞和原始內(nèi)胚層；當其表達水平降低至正常的1/2 時轉(zhuǎn)為滋養(yǎng)層。 因此，其表達水平需保持在較窄范圍內(nèi)以維持細胞多能性的表型。 本研究結(jié)果顯示，Sox2、Oct4 在20 例正常肺組織中表達全部為陰性，在60 例肺癌中，Sox2 陽性28例，陽性表達率為46.7%，Oct4 陽性43 例，陽性表達率為71.7%。 病理分期、病理分型與分化程度不同的患者Sox2、Oct4 的表達存在明顯差異（P ＜0.05），而不同年齡、性別的患者Sox2、Oct4 的表達無明顯差異（P ＞0.05），說明Sox2、Oct4 的表達會加速腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和分化，對腫瘤的預后有嚴重影響。 研究認為肺癌的發(fā)生、發(fā)展與Sox2 與Oct4 密切相關，且通過協(xié)同作用共同促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]，但對Sox2 和Oct4在肺癌組織中的交叉表達分析結(jié)果顯示，兩者并無明顯相關性，由于作用機制尚未明確，尚不能排除它們之間的協(xié)同作用，需要有大量的后續(xù)研究進一步對其進行分析探索。

綜上所述，Sox2 與Oct4 在肺癌組織中呈明顯高水平表達，并與腫瘤的病理分型、分期及分化程度密切相關，因此Sox2、Oct4 可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，在肺癌的診斷及預后評價中有著重要意義。

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