正交試驗優(yōu)選苦石蓮膠囊乙醇提取工藝

唐炳蘭 莫單丹 劉振杰 袁經(jīng)權(quán) 周小雷 繆劍華廣西藥用植物研究所天然藥物化學(xué)組分研究室，廣西南寧 530001

苦石蓮膠囊是廣西藥用植物研究所根據(jù)民間驗方自制的單方制劑，具有消炎、抗菌、抗病毒、護(hù)肝等功效[1-3]，常用于感冒和肝炎的防治。 苦石蓮系豆科云實屬植物喙莢云實（南蛇簕）Caesalpinia minax Hance的種子，性涼，味苦，有清熱解毒、化濕、散瘀止痛之功效，主治風(fēng)熱感冒、痢疾、淋濁、癰腫、瘡癬、跌打損傷、毒蛇咬傷等，為瑤藥經(jīng)典老班藥中“七十二風(fēng)”中的南蛇風(fēng)[4-5]。 化學(xué)成分主要有二萜類、黃酮類、揮發(fā)油成分、植物甾醇類，現(xiàn)代藥理研究表明其中所含的二萜類化合物具有抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，是其發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。 本研究前期對苦石蓮的化學(xué)成分做了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其富含卡山烷二萜類化合物Neocaesalpin L，且藥理研究發(fā)現(xiàn)Neocaesalpin L有較好的抗流感病毒和抗瘧疾活性，可能是苦石蓮活性物質(zhì)之一。 本試驗采用L9（34）正交試驗法，以Neocaesalpin L 化合物為評價指標(biāo)，優(yōu)選苦石蓮膠囊的提取工藝參數(shù)，從而為實際生產(chǎn)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司， 含柱溫箱， 標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器，DAD 陣列檢測器，Agilent Chemstation 化學(xué)工作站），KQ-5200 型數(shù)控超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司），電子分析天平（CP2250D，Sartorius），101-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠），W201 型恒溫浴鍋（上海申生科技有限公司），高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

Neocaesalpin L 對照品（自制，經(jīng)NMR、HPLC 測定，純度＞98%）；苦石蓮（購自民間瑤醫(yī)），經(jīng)廣西藥用植物園藥用資源保護(hù)與遺傳改良中心趙以民博士鑒定為豆科云實屬植物喙莢云實Caesalpinia minax Hance 的干燥種子；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Neocaesalpin L 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：伊力特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.5%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫（乙腈在0～25 min 由20%→50%，26～30 min 由50%→20%）；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：0.8 mL/min；理論塔板數(shù)按Neocaesalpin L 峰計算應(yīng)不低于5000。

2.1.2 對照品溶液的制備和線性關(guān)系

精密稱取Neocaesalpin L 對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.243 mg 的溶液，即得。 分別精密吸取對照品溶液6、8、10、12、14、16 μL 注入高效液相色譜儀，測定峰面積。 以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=18.4X+388（r= 0.9996）。 表明Neocaesalpin L 在1.458～3.888 μg 范圍的線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（50 目篩）約5 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液12 μL 注入高效液相色譜儀， 連續(xù)進(jìn)樣6 次， 測得Neocaesalpin L 的峰面積RSD 為0.32%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣12 μL，測得Neocaesalpin L 的峰面積RSD 為1.14%（n = 6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣12 μL，測得Neocaesalpin L 含量的RSD 為1.95%（n = 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密稱定已測含量的同一批樣品，共9 份，分別精密加入樣品的80%、100%、120%的Neocaesalpin L對照品各3 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取12 μL 進(jìn)樣， 按上述色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率。 結(jié)果Neocaesalpin L 平均回收率為96.76%，RSD = 1.59%（n = 9）。

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗[7-8]

2.2.1.1 提取方法考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按 “2.1.1” 項下色譜條件進(jìn)樣測定Neocaesalpin L 的含量，比較超聲法、回流法、浸漬法的提取效果，結(jié)果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.4365、0.2092、0.3288 mg/g 生藥材，以超聲提取為佳。2.2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 精密稱取苦石蓮粉末（50目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、95%的乙醇， 超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解， 并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定Neocaesalpin L 的含量，結(jié)果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.1702、0.1723、0.1781、0.2033、0.4942 mg/g生藥材， 故正交試驗乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、95%。

2.2.1.3 提取時間考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL 95%乙醇，超聲提取2 次，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1” 項下色譜條件進(jìn)樣測定Neocaesalpin L 的含量， 結(jié)果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.3560、0.6838、0.6312、0.4323、0.4297 mg/g 生藥材，故正交試驗選擇提取時間為1.0、1.5、2.0 h。

2.2.1.4 提取次數(shù)考察 精密稱取苦石蓮粉末（50 目篩）5 g，置于250 mL 具塞錐形瓶中，分別加100 mL 95%的乙醇， 超聲提取4 次，1 h/次， 提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定Neocaesalpin L 的含量，結(jié)果顯示Neocaesalpin L 的 含 量 分 別 為0.4684、0.1700、0.029、0 mg/g生藥材， 故正交試驗提取次數(shù)因素的3 個水平為1、2、3 次。

2.2.1.5 乙醇用量考察 精密稱取苦石蓮粉末 （50 目篩）5 g， 置于250 mL 具塞錐形瓶中， 分別加10、15、20、25、30 倍95%的乙醇，超聲提取2 次，1 h/次，提取液過濾合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取12 μL 按“2.1.1” 項下色譜條件進(jìn)樣測定Neocaesalpin L 的含量， 結(jié)果顯示Neocaesalpin L 的含量分別為0.2978、0.4901、0.6003、0.6228、0.6245 mg/g 生藥材，可知隨著溶劑量增大，Neocaesalpin L 的提取率也相應(yīng)增高，但達(dá)到20 倍后提取率沒有明顯提高，考慮到提取成本，故正交試驗確定乙醇用量因素的3 個水平為15、20、25 倍。

2.2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.2.1 正交試驗因素與水平的選擇 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報道[9-17]， 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）、乙醇用量（D）為考察因素，每個因素設(shè)置3 個水平，采用L9（34）正交試驗表安排試驗。 正交試驗因素見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2.2.2 正交試驗結(jié)果 取苦石蓮粉末約5 g， 精密稱定，共9 份。按表1 中各條件進(jìn)行超聲提取，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定Neocaesalpin L 含量，以此為評價指標(biāo)進(jìn)行分析。 由表2 可知，4 個因素對Neocaesalpin L 含量的影響順序依次為B＞A＞C＞D，由表3 可知，影響提取效果的主要因素是提取次數(shù)（B），其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)（A），次要因素是提取時間（C）和乙醇用量（D），其中乙醇用量的影響最小，故將其作為誤差統(tǒng)計用以檢驗其他因素作用的顯著性。各因素不同水平對Neocaesalpin L 提取效果的影響順序為B2﹥B3﹥B1，A3﹥A2﹥A1，C2﹥C1﹥C3，D3﹥D1﹥D2。 綜合以上分析，確定最佳提取條件為A3B2C2D3，即95%乙醇，提取次數(shù)2 次，提取時間1.5 h，每次用25 倍量溶劑。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

2.2.2.3 驗證試驗 為考察優(yōu)化后最佳提取工藝的合理性，按該提取工藝條件進(jìn)行3 批驗證試驗，結(jié)果顯示Neocaesalpin L 含量分別為0.6030、0.5828、0.5849 mg/g，說明本提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本試驗采用正交試驗法，以二萜化合物Neocaesalpin L 提取率為指標(biāo)， 對苦石蓮膠囊的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選， 確定最佳提取工藝為25 倍量95%乙醇超聲提取2 次，1.5 h/次， 經(jīng)驗證試驗表明該工藝條件穩(wěn)定，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供一定的參考價值。

中草藥的功效通常不是依靠單一成分的作用，而是多種活性成分共同作用的結(jié)果，僅對其中一個或者幾個成分來控制中藥制劑的質(zhì)量、療效和穩(wěn)定性不夠全面。苦石蓮的主要化學(xué)成分為二萜類、黃酮類、植物甾醇類，目前已有文獻(xiàn)報道，采用可見分光光度法，以化合物Caesalpinins K 為對照品， 對苦石蓮總二萜的含量進(jìn)行測定和提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；以蘆丁為評價指標(biāo)，通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化苦石蓮總黃酮超聲波-乙醇提取工藝[18-19]。本試驗采用高效液相色譜法對苦石蓮中另一個二萜化合物Neocaesalpin L 含量進(jìn)行測定，并以其為指標(biāo)通過正交試驗優(yōu)選苦石蓮膠囊的乙醇提取工藝，可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)之一，也可以為苦石蓮藥材的進(jìn)一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

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