高效液相色譜法測定氯普噻噸片中E-異構(gòu)體含量

孫 桐，莊 航，葛雪松，張新勇

(江蘇省宿遷市食品藥品檢驗所，江蘇 宿遷 223800)

氯普噻噸片用于治療急、慢性精神分裂癥，適用于伴有精神運動性激越、焦慮、抑郁癥狀的精神障礙。氯普噻噸為硫雜蒽類抗精神病藥，可通過阻斷腦內(nèi)神經(jīng)突觸后多巴胺受體而改善精神障礙，也可抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，起到鎮(zhèn)靜作用，還可抑制延腦化學(xué)感受區(qū)而發(fā)揮止吐作用，并有抗抑郁及抗焦慮作用。氯普噻噸分子結(jié)構(gòu)中存在雙鍵，有順式和反式2 種異構(gòu)體，順式(氯普噻噸)的抗精神病作用為反式(E-異構(gòu)體)的8 倍，這可能是順式異構(gòu)體能與多巴胺分子部分重疊所致[1]。該藥現(xiàn)行標準《中華人民共和國藥典·2010 年版第一增補本》氯普噻噸片有關(guān)物質(zhì)檢查項下，并未限定E-異構(gòu)體的含量，難以控制該藥品的質(zhì)量。為確保療效，參考文獻[2 -4]，本研究采用高效液相色譜法對本品進行氯普噻噸E-異構(gòu)體的含量檢查。

1 儀器與試藥

Waters 2695/2487 型高效液相色譜儀;XP205 Mettler Toledo 電子天平。氯普噻噸對照品(European Pharmacopoeia Reference Standard)，含2.0%E-異構(gòu)體;氯普噻噸片(上海信誼藥廠有限公司，批號分別為130101，130217，130517，規(guī)格為每片含25 mg);磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、甲醇均為色譜純，四丁基溴化銨為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:1.5 mL/min;柱溫:30 ℃;流動相:以磷酸鹽緩沖溶液(取磷酸二氫鉀6.0 g、十二烷基硫酸鈉2.9 g、四丁基溴化銨9 g，加水550 mL溶解)-甲醇-乙腈(55 ∶5 ∶40)[1-2];流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm。

2.2 溶液制備

避光操作，取氯普噻噸對照品100.06 mg，置100 mL 容量瓶中，加乙腈20 mL 溶解，加流動相稀釋至刻度，作為對照品貯備溶液;精密量取1，2，3，5，10 mL，分別置20 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。避光操作，取本品20 片，研細，稱取相當于含50 mg 的氯普噻噸的細粉，置50 mL 容量瓶中，加乙腈10 mL 溶解，加流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗:按處方取相同輔料混合，制成不含氯普噻噸的陰性對照品溶液。取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀測定，色譜圖見圖1 。結(jié)果表明，輔料對E-異構(gòu)體測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:取對照品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=37 919 X-178，r=0.999 8。結(jié)果表明，氯普噻噸E-異構(gòu)體質(zhì)量濃度在1.001 ～10.015 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密量取對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。結(jié)果E-異構(gòu)體峰面積的RSD=0.9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密量取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，20 h 時進樣20 μL 測定。結(jié)果E-異構(gòu)體峰面積的RSD=1.2%(n=6)，表明供試品溶液在20 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密量取同一批樣品9 份，每份加入適量的E-異構(gòu)體，按2.2 項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL 測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 E-異構(gòu)體加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取含E-異構(gòu)體對照品溶液與2.2 項下制備的供試品溶液，進樣20 μL，按外標法計算樣品含量。結(jié)果批號分別為130101，130217，130517 的樣品中E-異構(gòu)體含量分別為0.18%，0.27%，0.31%。

3 討論

由于氯普噻噸的E-異構(gòu)體國內(nèi)無對照品供應(yīng)，進口對照品價格昂貴，自行配制合成難度大，故選擇相對便宜的進口氯普噻噸對照品(European Pharmacopoeia Reference Standard，含2.0%E-異構(gòu)體)，其中含有的E-異構(gòu)體已做定量，通過換算，完全可以替代E-異構(gòu)體對照品進行定量定性檢測。

現(xiàn)行歐洲藥典(EP7.5)和美國藥典(USP32)均收錄氯普噻噸片，采用主成分自身對照法對E-異構(gòu)體的含量進行計算，規(guī)定其含量不得超過0.3%。而現(xiàn)行標準2010 年版《中國藥典·第一增補本》氯普噻噸片有關(guān)物質(zhì)檢查項下，沒有引入對照品進行系統(tǒng)適用性試驗，只規(guī)定主峰和相鄰雜質(zhì)峰分開。引入氯普噻噸E-異構(gòu)體對照品，可使檢驗人員正確執(zhí)行有關(guān)物質(zhì)檢查項檢驗。試驗證明，氯普噻噸E-異構(gòu)體與氯普噻噸分離度大于7.5，可使各雜質(zhì)組分有效分開。

本研究中參考歐洲藥典，試驗時考察了甲醇-磷酸鹽緩沖液、甲醇-水、乙腈-磷酸鹽緩沖液、甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液等流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相體系中加入磷酸鹽緩沖溶液可有效預(yù)防色譜峰拖尾，甲醇-磷酸鹽緩沖液體系對雜質(zhì)的分離效果差，而在乙腈-磷酸鹽緩沖液體系中加入適量甲醇，E-異構(gòu)體的峰形更佳。故最終選擇甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液體系作為流動相。為了滿足主成分與E-異構(gòu)體的分離效果，主要通過調(diào)節(jié)流動相中乙腈含量的方法來解決。乙腈量超過15%時，消除了溶劑峰對主成分峰的影響，而乙腈量到50%時，主成分峰與E-異構(gòu)體峰不能有效分離。綜合考慮，選擇磷酸鹽緩沖溶液(取磷酸二氫鉀6.0 g、十二烷基硫酸鈉2.9 g、四丁基溴化銨9 g，加水550 mL 溶解)-甲醇-乙腈(55 ∶5 ∶40)為流動相。

[1] 潘振民. 立體異構(gòu)藥物的藥理效應(yīng)[J]. 中國藥業(yè)，1997，6(4):16-17.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典·2010 年版第一增補本[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:496.

[3] 陳建琴. 反相高效液相色譜法測定氯普噻噸片的含量[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24(3):222 -223.

[4] 陳素來. 對中國藥典氯普噻噸片含量測定中氯仿提取法的改進建議[J]. 藥物分析雜志，1998，18(2):118 -119.