加味雙柏軟膏的制備及質(zhì)量控制

車艷楠，曹麗萍，李曙光

(1. 廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033; 2. 廣東省深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518133)

加味雙柏軟膏是深圳市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，主要由黃柏、側(cè)柏葉、大黃、乳香、沒藥、澤蘭、薄荷共7 味中藥組方，具有活血化瘀、消腫止痛功效，用于跌打骨折、扭挫傷、筋肉腫痛。筆者對加味雙柏軟膏的制備工藝進(jìn)行了研究，制備加味雙柏軟膏，并對其質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司);Sartorius BP 211D 型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius 公司);MQ 密理博超純水機(jī)，CQ-250-DST 型超聲波清洗儀(250 W/40 kHz，上海生析超聲儀器有限公司)。黃柏等藥材經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室檢驗(yàn)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);水為超純水;甲醇為色譜純(德國Merck 公司);其他試劑為分析純;鹽酸黃柏堿(111895 -201202) 、槲皮素(100081-200907)、大黃素(110756-200110)、大黃酚(110796 -201118)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備工藝

按處方稱取藥材，薄荷、乳香、沒藥3 味水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油備用，藥液濾過，濃縮至相對密度1.30 ～1.32(85 ℃)冷卻，加乙醇使含醇量為60%，攪勻，靜止24 h，取上清液，備用;其他黃柏等4 味加65%乙醇回流提取2 次(10 倍、8倍)，濾過，合并提取液，與上述醇沉液合并，回收乙醇，濃縮至相對密度1.30 ～1.32(85 ℃)，冷卻，得清膏。取一定量白凡士林、羊毛脂、白蜂蠟、液體石蠟，加熱至熔融，加入上述清膏，混勻，冷卻至40 ℃，加入揮發(fā)油及十二烷基磺酸鈉、尼泊金乙酯、氮酮適量，混勻，冷卻至室溫，即得。

2.2 薄層色譜鑒別

黃柏:取本品5 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸黃柏堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取上述2 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一0.2%氫氧化鈉硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30 ∶15 ∶4)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1 A。

側(cè)柏葉: 取本品15 g，加甲醇20 mL，超聲1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5 ∶2 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，80 ℃加熱2 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜 柱:ECOSIL C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(83 ∶17);流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:254 nm。理論板數(shù)以大黃素峰計(jì)算不低于5 000。色譜圖見圖2。

2.3.2 溶液制備

精密稱取大黃素對照品10.47 mg、大黃酚對照品26.29 mg，置100 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，分別精密量取上述對照品溶適量，加甲醇稀釋至一定量，混勻，制得系列對照品溶液，分別含大黃素2.094，4.188，10.47，20.94，31.41，41.88 μg/mL，含大 黃酚5.258，10.516，26.29，52.58，78.87，105.16 μg/mL。取本品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加10%鹽酸溶液10 mL，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。取處方量藥材(缺大黃)，同法制得缺大黃陰性樣品，同法制得缺大黃陰性對照品溶液。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取上述系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定大黃素、大黃酚峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得大黃素回歸方程Y=31 380 X-69，r=0.999 9，結(jié)果表明，大黃素質(zhì)量濃度在2.012 ～50.3 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系;大黃酚回歸方程Y=44 994 X-229，r=0.999 9，結(jié)果表明，大黃酚質(zhì)量濃度在5.258 ～105.16 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取同一大黃素、大黃酚對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定。結(jié)果的RSD 分別為0.46%和0.48% ( n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12 h 時(shí)依法進(jìn)樣。結(jié)果大黃素、大黃酚含量的 RSD 分別為1.07% 和1.02% ( n=5)，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，精密稱定5 份，分別制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果大黃素含量0.364 5 mg/g，RSD 為1.17% ;大黃酚含量為0.922 1 mg/g，RSD 為1.21%( n=5)，表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的供試品0.5 g(大黃素0.364 5 mg/g，大黃酚0.922 1 mg/g)，共9 份，分別加混合對照品溶液(大黃素0.104 7 g/L、大黃酚0.266 9 g/L)1，2，3 mL 各3份，依法制備溶液，分析并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.3.4 樣品含量測定

取3 批加味雙柏軟膏，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定大黃素、大黃酚峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=9)

表2 樣品中大黃素、大黃酚含量測定結(jié)果

3 討論

加味雙柏軟膏以黃柏、側(cè)柏葉、大黃為君藥，乳香、沒藥為臣藥，共奏活血止痛、清熱消腫、散瘀之功，主要用于跌打骨折、扭挫傷筋、跌打損傷早期等病，現(xiàn)代藥理作用主要表現(xiàn)為抗炎、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)等?，F(xiàn)代藥理研究表明，側(cè)柏葉具有抗炎作用[1]，主要成分槲皮素有良好的舒張血管、保護(hù)內(nèi)皮功能的作用[2];黃柏能夠消除腫脹、改善血管通透性過高，具有抗炎消腫作用，5%黃柏注射液對骨細(xì)胞蛋白糖代謝有促進(jìn)作用[3];大黃具有抗炎、減輕血管損傷后內(nèi)膜增生病變的形成等作用[4]，大黃素具有抗炎等作用[5-6]。側(cè)柏葉等藥主要成分在乙醇中均有較好溶解，故采用乙醇提取法。乳香、沒藥、薄荷3 藥均主含揮發(fā)油等成分，故采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。加味雙柏軟膏按文中提取方法，能較好地提取有效成分。

大黃含游離蒽醌和結(jié)合型蒽醌，通過鹽酸回流水解，得到游離大黃素、大黃酚，再測定含量，能較準(zhǔn)確地反映真實(shí)含量。通過對大黃素、大黃酚二極管陣列光譜提取分析，大黃素、大黃酚在254 nm 波長附近均有較大吸收峰，且無干擾，故選取254 nm 為檢測波長。采用甲醇-水(85 ∶15)，甲醇-水系統(tǒng)雖易平衡、易清洗，但峰形拖尾、理論板較低。采用甲醇-1%磷酸溶液(83 ∶17)作為流動(dòng)相分離度良好、峰形對稱，且其他成分對此無干擾，故選用此流動(dòng)相。采用TLC 法鑒別側(cè)柏葉、黃柏，斑點(diǎn)清晰;采用HPLC 法測定大黃素、大黃酚的含量，分離度良好，專屬性強(qiáng)，且操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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