黑果枸杞口服液對正常小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響

李永慧， 孫朝輝， 山永凱， 楊全余， 李永芳*

（1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院，青海西寧810002；2.格爾木源鑫堂生物科技有限公司，青海格爾木816000；3.西寧之也生物科技咨詢服務(wù)有限公司，青海 西寧810003；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧810001）

黑果枸杞口服液對正常小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響

李永慧1， 孫朝輝2， 山永凱3， 楊全余4， 李永芳4*

（1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院，青海西寧810002；2.格爾木源鑫堂生物科技有限公司，青海格爾木816000；3.西寧之也生物科技咨詢服務(wù)有限公司，青海 西寧810003；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧810001）

目的研究黑果枸杞口服液對正常小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響。方法健康小鼠40只，隨機分為4組：正常對照組，黑果枸杞口服液低、高劑量組和陽性對照組。正常對照組灌胃給予生理鹽水，陽性對照組灌胃給予維生素C，黑果枸杞口服液低、高劑量組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的黑果枸杞口服液，連續(xù)給藥28 d，記錄不同時間小鼠的體質(zhì)量，并在28 d后眼眶采血及取肝組織，用試劑盒測定小鼠血清和肝臟中丙二醛 （MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力、總抗氧化能力（T-AOC）和過氧化氫酶（CAT）活力。結(jié)果在不同時間小鼠的體質(zhì)量各組間沒有明顯差異，與正常對照組相比，低、高劑量的黑果枸杞口服液能顯著降低小鼠血清和肝組織中MDA水平，明顯提高小鼠血清和肝組織中SOD、GSH-PX、T-AOC、CAT的活性。結(jié)論黑果枸杞口服液具有顯著的小鼠體內(nèi)抗氧化活性。

黑果枸杞口服液；抗氧化；小鼠

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr）屬茄科枸杞屬的耐鹽、抗旱多棘刺灌木，主要分布在我國的青海、新疆、甘肅、寧夏等地區(qū)。其中柴達木盆地因其獨特的自然地理條件和氣候條件，非常適宜黑果枸杞的生長，是我國枸杞的原生地之一，天然野生枸杞在此廣有分布。黑果枸杞富含氨基酸、花青素、維生素C和脂肪等［1］，是藏醫(yī)藥中的常用藥材。藏醫(yī)以其成熟的果實入藥，其味甘，性平，具有清心熱、補腎養(yǎng)肝、潤肺明目之功效，用于治療心熱病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明［3-7］：黑果枸杞提取物具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等廣泛的藥理作用，且毒副作用少，藥源豐富，使用方便，具有良好的保健價值和藥用價值?？砷_發(fā)生產(chǎn)食品 （保健飲料、果醬等）、保健品、釀酒、食用黑色素、染料等。本實驗對黑果枸杞口服液的體內(nèi)抗氧化作用進行研究，為更好地開發(fā)和利用黑果枸杞提供基礎(chǔ)資料。

1 實驗材料

1.1 動物 健康清潔級昆明種小鼠40只，體質(zhì)量 （20± 2）g，雌雄各半。購于蘭州大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK（甘）2013-0002。

1.2 藥品 黑果枸杞口服液，由格爾木源鑫堂生物科技有限公司提供。其主要原料為青藏高原野生黑果枸杞和柴達木枸杞。采用兩次水浸提法，分別提取黑果枸杞和柴達木枸杞，將黑果枸杞提取液與柴達木枸杞提取液用硅藻土進行精濾，用果膠酶—明膠法處理后，按黑果枸杞提取液45%，柴達木枸杞提取液35%，白砂糖5%，檸檬酸0.1%配方進行調(diào)配，為了增加黑果枸杞口服液的穩(wěn)定性分別加入羧甲基纖維素鈉0.1%，黃原膠0.2%，用純凈水定容攪拌均勻后高速乳化剪切，再用60目濾布過濾，得色澤藍紫色的黑果枸杞口服液；其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為每100 mL口服液中原花青素≥300 mg，枸杞多糖≥850 mg，可溶性固形物≥10%，總酸 （以檸檬酸計）≥0.2%～1.0%。

維生素C購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑 丙二醛（ma1ondia1ehyde，MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（g1utathione peroxidase，GSH-PX）測試盒、總抗氧化能力（tota1antioxidant capacity，T-AOC）測試盒、過氧化氫酶（cata1ase，CAT）測試盒和BCA法蛋白定量測試盒均購于南京建成生物工程有限公司。

1.4 儀器 JJ-1型精密增力電動攪拌器 （上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；DU-800型分光光度計 （上海第三分析儀器廠）；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 （上海精密實驗設(shè)備有限公司）；TDL-4型離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 40只昆明小鼠隨機分為4組：正常對照組、黑果枸杞口服液低劑量組、黑果枸杞口服液高劑量組和陽性 （維生素C）對照組。每組10只，雌雄各半。

2.2 給藥 各組小鼠每天上午灌胃給藥1次，黑果枸杞口服液低劑量組和高劑量組分別給予0.05 mL/10 g和0.1 m L/10 g的黑果枸杞口服液 （低劑量和高劑量分別為人用劑量的10倍和20倍，推薦人用的劑量為每天30 mL），陽性對照組給予0.2mg/10 g的維生素C，正常對照組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥4周，實驗期間飼喂普通飼料，自由攝食和飲水。小鼠每隔1周稱量1次體質(zhì)量。

2.3 血清和肝組織勻漿制備 實驗結(jié)束后，將小鼠禁食12 h，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，分離血清待用。取血后的小鼠頸椎脫臼處死，取出肝臟，用冰冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，濾紙吸干水分，稱取肝組織塊0.4 g，置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的生理鹽水3.6 mL，在冰水浴的條件下，制備成10%的肝組織勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.4 生化測定方法 硫代巴比妥酸法（thibatituric acid， TBA法）測定肝組織和血清中丙二醛 （MDA）水平；Fe3+還原法測定總抗氧化能力 （T-AOC）；黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶 （SOD）活力；二硫?qū)ο趸郊姿岱y定谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）活力；可見光法測定過氧化氫酶 （CAT）活力；微量酶標(biāo)法 （BCA法）測定肝組織蛋白含有量。具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用t檢驗，其中，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 黑果枸杞口服液對小鼠體質(zhì)量的影響 在整個實驗過程中，各組實驗小鼠生長良好，體質(zhì)量都是隨時間逐漸增長。黑果枸杞口服液低、高劑量組和維生素C陽性對照組在同一時間點的體質(zhì)量與正常對照組之間并無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 黑果枸杞口服液對小鼠體質(zhì)重的影響 （）

表1 黑果枸杞口服液對小鼠體質(zhì)重的影響 （）

組別小鼠體質(zhì)量/g 0周 1周 2周 3周 4周25.31±2.75 27.3±3.27 30.31±3.76 32.27±4.29 33.87±4.11 25.38±2.18 29.14±2.01 32.24±3.12 34.28±2.47 35.62±3.13陽性對照組 24.41±2.34 27.25±1.23 29.25±1.87 32.66±2.35 33.36±2.27黑果枸杞口服液低劑量組 25.25±1.72 28.55±2.96 31.32±3.62 33.87±4.22 34.31±3.59黑果枸杞口服液高劑量組正常對照組

3.2 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織總抗氧化能力（T-AOC）的影響 與正常對照組比較，黑果枸杞口服液低、高劑量組和維生素C陽性對照組的血清和肝組織中TAOC均明顯增高 （P＜0.05）。說明灌服不同劑量的黑果枸杞口服液后可提高小鼠血清和肝臟組織中T-AOC活性，且存在一定的量效關(guān)系。與維生素C陽性對照組相比，黑果枸杞口服液低、高劑量組血清和肝組織中T-AOC無顯著性差異 （P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織總抗氧化能力 （T-AOC）的影響 （）

表2 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織總抗氧化能力 （T-AOC）的影響 （）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05

組別 動物數(shù)/只 劑量 總抗氧化能力（T-AOC）血清/（U·mL-1） 肝/（U·mgprot-1）正常對照組 10 ——6.65±1.12 2.89±0.56陽性對照組 10 0.2 mg/10 g 8.79±1.35* 3.82±1.02*黑果枸杞口服液低劑量組 10 0.05 m L/10 g 8.25±1.34* 3.76±0.97*黑果枸杞口服液高劑量組 10 0.1 m L/10 g 8.32±1.41* 3.99±1.11*

3.3 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織過丙二醛（MDA）的影響 與正常對照組相比，灌服低、高劑量的黑果枸杞口服液后，小鼠血清和肝組織中的MDA水平明顯下降 （P＜0.05或P＜0.01），尤其以高劑量的黑果枸杞口服液更明顯。但與陽性對照組、低劑量組之間無顯著性差異。說明黑果枸杞口服液對小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷有保護作用，其作用與維生素C相當(dāng)。結(jié)果見表3。

表3 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織過丙二醛 （M DA）的影響 （）

表3 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織過丙二醛 （M DA）的影響 （）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 劑量 丙二醛（MDA）血清/（nmo1·m L-1） 肝/（nmo1·mgprot-1）正常對照組 10 ——8.72±2.86 14.54±1.47陽性對照組 10 0.2 mg/10 g 4.97±2.69* 11.45±1.62**黑果枸杞口服液低劑量組 10 0.05 m L/10 g 6.09±2.18* 11.53±1.32*黑果枸杞口服液高劑量組 10 0.1 m L/10 g 5.94±2.32* 10.98±1.94**

3.4 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響 黑果枸杞口服液低、高劑量組和陽性對照組小鼠血清和肝組織中SOD明顯高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01），黑果枸杞口服液低、高劑量組小鼠血清和肝組織中SOD高于陽性對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），小鼠血清和肝組織中SOD在黑果枸杞口服液低、高劑量組之間無顯著性差異 （P＞0.05）。說明黑果枸杞口服液和維生素C一樣，能顯著提高小鼠體內(nèi)SOD活性。結(jié)果見表4。

表4 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶 （SOD）活力的影響 （）

表4 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶 （SOD）活力的影響 （）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 劑量 超氧化物歧化酶（SOD）活力血清/（U·mL-1） 肝/（U·mgprot-1）正常對照組 10 ——8.89±3.05 229.53±19.32陽性對照組 10 0.2 mg/10 g 12.35±1.56* 263.25±24.32*黑果枸杞口服液低劑量組 10 0.05 m L/10 g 12.57±3.99* 269.08±39.79*黑果枸杞口服液高劑量組 10 0.1 m L/10 g 14.33±5.37* 273.44±25.94**

3.5 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力的影響 黑果枸杞口服液低、高劑量組和陽性對照組小鼠血清和肝組織中GSH-PX明顯高于正常對照組 （P＜0.05或P＜0.01），以黑果枸杞口服液高劑量組最明顯，其肝組織中GSH-PX明顯高于陽性對照組和黑果枸杞口服液低劑量組 （P＜0.05或P＜0.01），說明灌胃0.05 mL/10 g和0.1mL/10 g的黑果枸杞口服液可顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力，且0.1 mL/10 g的黑果枸杞口服液作用更明顯。結(jié)果見表5。

表5 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）活力的影響 （）

表5 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）活力的影響 （）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與黑果枸杞口服液高劑量組比較，+P＜0.05，++P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 劑量 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力血清/（U·mL-1） 肝/（U·mgprot-1）正常對照組 10 ——982.5±260.2 639.8±167.6陽性對照組 10 0.2 mg/10 g 1312.8±241.2* 894.6±82.6**黑果枸杞口服液低劑量組 10 0.05 m L/10 g 1308.8±329.2*+ 860.5±128.1**++黑果枸杞口服液高劑量組 10 0.1 m L/10 g 1411.1±343.6* 1175.5±286.7**#

3.6 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織過氧化氫酶（CAT）活力的影響 黑果枸杞口服液低、高劑量組和陽性對照組小鼠血清和肝組織中CAT明顯高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01），以黑果枸杞口服液高劑量組最明顯，其血清中CAT明顯高于陽性對照組和黑果枸杞口服液低劑量組 （P＜0.05），說明黑果枸杞口服液可顯著提高CAT的活力，且呈劑量依賴性。結(jié)果見表6。

表6 黑果枸杞口服液對小鼠血清和肝組織過氧化氫酶 （CAT）活力的影響 （）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與黑果枸杞口服液高劑量組比較，+P＜0.05

組別 動物數(shù)/只 劑量 過氧化氫酶（CAT）活力血清/（U·mL-1） 肝/（U·mgprot-1）正常對照組 10 ——4.49±2.23 185.42±22.15陽性對照組 10 0.2mg/10 g 8.42±2.23* 221.58±14.86**黑果枸杞口服液低劑量組 10 0.05 m L/10 g 7.37±1.96*+ 216.04±17.69**黑果枸杞口服液高劑量組 10 0.1mL/10 g 9.82±1.21**# 224.89±19.59**

4 討論

機體在生命過程中會不斷產(chǎn)生氧自由基，過多的自由基會攻擊蛋白質(zhì)、脂肪、DNA等生物大分子，破壞細胞結(jié)構(gòu)，干擾人體的正常代謝活動，引起疾病，加速人體的衰老［8-9］。因此自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和某些疾病的重要因素。正常情況下，體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，直接清除體內(nèi)過剩的自由基，有效地防止或減輕體內(nèi)自由基所導(dǎo)致的氧化損傷，增強機體免疫能力，延緩衰老。超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶 （CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）是機體抗氧化系統(tǒng)中重要的酶，其活力高低反映了機體清除自由基能力的強弱。丙二醛（MDA）是動物體內(nèi)多元不飽和脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物之一，其水平的高低可以反映體內(nèi)不飽和脂質(zhì)的過氧化程度，間接地反映機體產(chǎn)生自由基的水平和細胞膜的損傷程度［10-11］。另外，總抗氧化能力也是評價機體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的一種常用指標(biāo)。因此，通過檢測體內(nèi)TAOC、MDA、SOD、CAT以及GSH-PX活性變化，可了解體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除情況。實驗結(jié)果表明，用低劑量和高劑量的黑果枸杞口服液灌胃小鼠能有效地降低小鼠血清和肝組織中MDA水平，顯著提高小鼠血清和肝組織中總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶的活力，但對小鼠的體質(zhì)量沒有明顯影響。說明黑果枸杞口服液能有效減少小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，增強體內(nèi)抗氧化酶活性，顯著提高體內(nèi)抗氧化能力。

黑果枸杞口服液是采用青藏高原野生黑果枸杞為主要原料，配以青藏高原獨有的柴達木枸杞提取液，分別經(jīng)挑選、清洗、提取、調(diào)配、過濾、均質(zhì)、脫氣等工藝制備而成。黑果枸杞藏藥名 “旁瑪”，其味甘、性平，富含蛋白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分［1］。還含有豐富的天然花青素，其花青素含有量超過藍莓，是迄今為止，發(fā)現(xiàn)花青素含有量最高的天然野生植物。原花青素OPC是最有效的天然水溶性自由基清除劑，其功效是維生素E的50倍［12-13］。枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，又是一種傳統(tǒng)的滋補保健食品。枸杞中含有枸杞多糖類、維生素類、類胡蘿卜類、色素類、生物堿類、甾醇類、脂肪類及脂肪酸類等成份，還含有人體必需的19種氨基酸和20多種的微量元素［14］。柴達木枸杞又叫青海枸杞，主要產(chǎn)于柴達木盆地。其獨具特色的高原大陸性氣候賦予柴達木枸杞更優(yōu)良的品質(zhì)。黑果枸杞和柴達木枸杞雖然都屬于茄科枸杞屬植物，但二者果實的營養(yǎng)成分和保健功能方面卻不盡相同。野生黑枸杞與柴達木枸杞相比，其維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分更豐富，尤其富含具有清除自由基、抗氧化功能的天然花色苷-花青素；柴達木枸杞富含枸杞多糖、胡蘿卜素、黃酮等［15］，同樣也有清除體內(nèi)垃圾，駐顏養(yǎng)容的功能。

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1001-1528（2015）08-1836-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.046

2014-04-04

李永慧 （1980—），女，主治醫(yī)師，從事消化內(nèi)科的臨床工作。Te1：（0971）6101969，E-mai1：qh1iyonghui@163.com

*通信作者：李永芳 （1971—），女，碩士，教授，從事中藏藥藥效學(xué)研究。Te1：（0971）6104046，E-mai1：qh1iyongfang@163.com