類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

高 莉， 彭曉明， 霍仕霞， 何 燕， 閆 明

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實驗室，新疆烏魯木齊830049）

類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

高 莉， 彭曉明， 霍仕霞， 何 燕， 閆 明*

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實驗室，新疆烏魯木齊830049）

目的觀察類葉升麻苷對連二亞硫酸鈉致PC12細(xì)胞缺糖缺氧損傷的保護(hù)作用。方法以1 mmo1/L連二亞硫酸鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立缺糖缺氧損傷模型，然后以0.1、1、10、100μmo1/L的類葉升麻苷拮抗其作用。倒置顯微鏡觀察PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT比色法測定細(xì)胞存活率，化學(xué)比色法測定細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿 （Ach）水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）及乙酰膽堿酯酶（TChE）活性。結(jié)果采用缺糖缺氧損傷PC12細(xì)胞后，Ach水平、ChAT活力均降低；與不同濃度的類葉升麻苷 （0.1、1、10、100μmo1/L）共孵育24 h后，各類葉升麻苷給藥組均可提高Ach水平及ChAT活力，而TChE活力無明顯變化。結(jié)論類葉升麻苷對連二亞硫酸鈉聯(lián)合無糖培養(yǎng)液造成PC12細(xì)胞缺糖缺氧損傷具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高ChAT活性進(jìn)而增加Ach水平有關(guān)。

類葉升麻苷；PC12細(xì)胞；連二亞硫酸鈉；乙酰膽堿酯酶

血管性癡呆（vascu1ar dementia，VD）是由一系列缺血性腦血管疾病所導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙綜合征，在我國血管性癡呆占各類癡呆發(fā)病的第一位。腦組織代謝旺盛，血流量豐富，因此極易受到缺血的影響，引起神經(jīng)細(xì)胞功能的損害［1］。類葉升麻苷 （acteoside）是肉蓯蓉的主要有效成分，且含有量較高，經(jīng)藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)記憶力、抗腫瘤等生物活性，有較為廣闊的開發(fā)前景［2］。

本實驗室前期實驗結(jié)果提示類葉升麻苷對動物認(rèn)知功能障礙有一定的改善作用，其機(jī)制可能與抗自由基生成和改善膽堿系統(tǒng)功能有關(guān)［3］。另外，也有學(xué)者研究證實類葉升麻苷對膽堿能系統(tǒng)產(chǎn)生影響［4］。雖然，目前有報道顯示類葉升麻苷具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［5-6］，但類葉升麻苷對缺糖缺氧（oxygen-g1ucose deficiency，OGD）細(xì)胞模型的作用未見相關(guān)報道。因此，為了進(jìn)一步探討類葉升麻苷對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的機(jī)制，本實驗利用體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞缺糖缺氧實驗?zāi)M體內(nèi)的缺血狀態(tài)，研究類葉升麻苷對連二亞硫酸鈉 （Na2S2O4）所致PC12細(xì)胞缺糖缺氧模型中膽堿系統(tǒng)的影響，以乙酰膽堿（acety1cho1ine，Ach）水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（cho1ine acety1transferase，ChAT）活力及乙酰膽堿酯酶（acety1cho1inesterase，AchE）活力為指標(biāo)，探討類葉升麻苷增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 藥物 類葉升麻苷分子質(zhì)量為624.59，由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實驗室提供，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜法和質(zhì)譜法確認(rèn)，高效液相色譜（HPLC）面積歸一化法鑒定其純度為95%。

1.2 細(xì)胞株 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 實驗試劑與儀器 胎牛血清（Hyc1one產(chǎn)品）；完全RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco產(chǎn)品）；無糖RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco產(chǎn)品）；氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素（Amersco公司）；連二亞硫酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠，20100710）；四甲基偶氮唑藍(lán) （美國Amresco公司）；二甲基亞砜 （天津市光復(fù)化工研究所）；乙酰膽堿 （ACh）測定試劑盒 （20130923）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 （ChAT）測試盒（20130923）、乙酰膽堿酯酶 （TChE）測試盒 （20130923）、BCA法蛋白定量測試盒 （20130918）均購自南京建成生物技術(shù)研究所。

1.4 實驗儀器 凈化工作臺（蘇凈，SW-CJ-1F）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司MCO-18AIC型）；倒置光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)六廠，37XB）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific 1510型）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5%CO2孵箱中，2～3 d換液1次，3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 PC12細(xì)胞OGD模型的建立及給藥［7］實驗設(shè)正常組、模型組和類葉升麻苷治療組。各組處理如下，模型組：根據(jù)文獻(xiàn)［8］方法加入1 mmo1/L的Na2S2O4處理細(xì)胞2 h，建立缺糖缺氧細(xì)胞模型；類葉升麻苷治療組：根據(jù)前期藥物濃度篩選選取0.1、1、10、100μmo1/L的類葉升麻苷與Na2S2O4處理細(xì)胞2 h后的細(xì)胞共孵育24 h；正常組則只加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)基。

2.3 四甲基偶氮唑藍(lán) （MTT）檢測細(xì)胞存活數(shù)［9］取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)為3×104個/m L均勻的鋪于96孔板，100μL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用1 mmo1/L Na2S2O4造模，3 h后按分組要求予以不同處理，培養(yǎng)48 h后每孔加終質(zhì)量濃度為5 mg/mL MTT反應(yīng)4 h后，吸去上清 （注意避免吸走甲瓚結(jié)晶），每孔加入200 μL DMSO，振蕩待孔內(nèi)結(jié)晶完全溶解后于490 nm處測OD值。

2.4 乙酰膽堿相關(guān)指標(biāo)測定 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)為5×104個/mL鋪48孔板，200μL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用1 mmo1/L Na2S2O4造模300μL/孔，3 h后按分組要求予以不同處理，培養(yǎng)48 h后，取每孔培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液按照試劑盒說明書分別測定乙酰膽堿 （Ach）水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 （ChAT）活力、乙酰膽堿酯酶（TChE）活力。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 類葉升麻苷對缺糖缺氧損傷PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞形態(tài)觀察可見，正常組細(xì)胞為多角形貼壁細(xì)胞，樹突明顯，折光度強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量多，而模型組用1 mmo1/L Na2S2O4損傷，細(xì)胞數(shù)減少，樹突回縮，且折光度減弱。模型中PC12細(xì)胞的損傷及藥物保護(hù)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本一致，但隨著加藥濃度的不同，各給藥組細(xì)胞損傷程度減輕，呈現(xiàn)一定的藥物保護(hù)形態(tài)，與模型組相比，細(xì)胞樹突增多且有聚集的現(xiàn)象。見圖1。

4.2 對細(xì)胞存活率的影響 PC12細(xì)胞用1 mmo1/L Na2S2O4造模3 h后，其抑制率達(dá)到35.9%，與正常組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01），表明造模條件可靠，造模成功。各個給藥組與模型組相比，亦可見給藥組細(xì)胞存活率增加，即類葉升麻苷可抑制Na2S2O4對PC12細(xì)胞所致的缺糖缺氧損傷，在1～100μmo1/L范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的升高，保護(hù)作用越強(qiáng)，且存在濃度依賴關(guān)系。見圖2。

圖2 類葉升麻苷對PC12細(xì)胞OGD模型存活率的影響（，n=6）

4.3 乙酰膽堿相關(guān)指標(biāo)的測定 實驗結(jié)果表明，1 mmo1/L Na2S2O4能引起PC12細(xì)胞Ach水平、ChAT活力及ChAT/ TChE比值均降低 （P＜0.01，P＜0.05）；與不同濃度類葉升麻苷共孵育后，四組類葉升麻苷劑量均可顯著提高Ach水平及ChAT活力（P＜0.01），對TChE活力無明顯影響，而ChAT/TChE比值逐漸升高。見表1。

表1 類葉升麻苷對Na2S2O4所致PC12細(xì)胞Ach以及ChAT、TChE的影響（，n=6）

表1 類葉升麻苷對Na2S2O4所致PC12細(xì)胞Ach以及ChAT、TChE的影響（，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01

ChAT/TChE正常組組別 劑量/（μmo1·L-1）Ach/（μg·mgprot-1）ChAT/（μg·mgprot-1）TChE/（μg·mgprot-1）10.8±0.35 0.77±0.09 1.48±0.39 0.54±0.11模型組 6.11±0.87** 0.23±0.03** 1.07±0.02 0.21±0.01*類葉升麻苷 0.1 13.49±1.5## 0.53±0.09## 1.59±0.21 0.34±0.08類葉升麻苷 1 8.84±0.98## 0.58±0.08## 1.59±0.31 0.37±0.09類葉升麻苷 10 10.26±2.05 0.63±0.17## 1.6±0.38 0.48±0.03##類葉升麻苷 100 12.57±0.51## 0.71±0.01## 1.03±0.09 0.69±0.06##

5 討論

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞株，細(xì)胞膜上有膽堿能M、N受體等，已廣泛用作研究神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體的實驗材料［1］，缺糖缺氧損傷PC12模型作為一種快速、敏感的體外中樞神經(jīng)缺血模型是目前較為公認(rèn)的研究腦缺血模型，常用于評價藥物潛在的神經(jīng)保護(hù)作用［7］。

神經(jīng)元損傷和死亡是由供血不足、營養(yǎng)物質(zhì) （葡萄糖）缺乏及代謝物的累積所導(dǎo)致的［8-9］。神經(jīng)元缺氧導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝障礙，產(chǎn)生內(nèi)源性細(xì)胞毒素，最終使細(xì)胞死亡。近年來［10］，人們對血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，越來越多的證據(jù)表明膽堿能系統(tǒng)參與了血管性癡呆的發(fā)生。血管性癡呆發(fā)生時中樞膽堿能系統(tǒng)受損，其認(rèn)知損害機(jī)制涉及膽堿能遞質(zhì)及其受體等方面的改變。而且臨床實驗研究已證明，膽堿能治療策略血管性癡呆有效［11-12］。賈建平等［13］學(xué)者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆患者腦脊液 （CSF）中Ach水平較對照組顯著降低，且下降幅度與癡呆程度成正關(guān)。眾所周知，Ach是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞突觸傳遞過程中的一種關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)，它由 ChAT催化合成，TChE催化分解［14］，其ChAT/AchE比值顯著影響Ach的表達(dá)水平［15］，所以本實驗選用乙酰膽堿水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力及乙酰膽堿酯酶活力為測試指標(biāo)，研究類葉升麻苷對OGD模型的保護(hù)作用。

本實驗采用Na2S2O4結(jié)合無糖培養(yǎng)液模擬腦缺血損傷神經(jīng)的狀態(tài)，進(jìn)行研究類葉升麻苷對離體的缺糖缺氧細(xì)胞模型的保護(hù)作用。MTT是廣泛地用于檢測細(xì)胞存活和增殖的指標(biāo)，它可以敏感的測量細(xì)胞代謝狀態(tài)。實驗中顯示，1 mmo1/L Na2S2O4可引起PC12數(shù)量減少，樹突回縮，其生存能力顯著下降，與0.1～100μmo1/L不同劑量類葉升麻苷共孵育后均能顯著增強(qiáng)細(xì)胞存活率，且呈現(xiàn)劑量依賴性。以上結(jié)果表明，類葉升麻苷在0.1μmo1/L劑量下即可明顯抑制 （P＜0.01）缺糖缺氧對細(xì)胞的損傷作用，能夠保護(hù)PC12細(xì)胞在體外受到的缺糖缺氧誘導(dǎo)損傷，對缺血造成的神經(jīng)損傷具有潛在保護(hù)性作用。另外，實驗中未觀察到類葉升麻苷對PC12細(xì)胞的毒性。

進(jìn)一步對Ach水平以及ChAT、TChE活性檢測發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞經(jīng)缺糖缺氧誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞內(nèi) Ach水平、ChAT活性明顯下降以及ChAT/TChE比值顯著下降（P＜0.05），提示Na2S2O4可能通過降低ChAT活力以及ChAT/ TChE比值 （P＜0.01），從而降低Ach水平。與不同劑量類葉升麻苷共孵育24 h后，各組的細(xì)胞內(nèi)Ach水平、ChAT活性以及ChAT/TChE比值均明顯不同程度的增高，在1～100μmo1/L劑量下隨著類葉升麻苷濃度升高，Ach水平和ChAT活性隨劑量逐步升高，TChE則無明顯變化。這些結(jié)果表明，類葉升麻苷能夠通過升高ChAT活力以及ChAT/ TChE比值，促進(jìn)Ach合成增加，增強(qiáng)Ach的神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)作用，從而保護(hù)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞細(xì)胞損傷，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

綜上所述，類葉升麻苷可改善PC12細(xì)胞形態(tài)，顯著提高細(xì)胞存活率，對Na2S2O4所致的PC12細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用；其保護(hù)作用可能與升高ChAT活力以及ChAT/ TChE活力比值，從而增高Ach水平有關(guān)，表明類葉升麻苷具有開發(fā)應(yīng)用于預(yù)防和治療腦缺血類血管性癡呆以及腦中風(fēng)后遺癥等藥物的潛能。

［1］孫 蓉，衣銀萍，呂麗莉，等.麝香酮對連二亞硫酸鈉造成PC12細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（1）：15-17.

［2］李 媛，宋媛媛，張洪泉.肉蓯蓉的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2010，29（1）：7-11.

［3］林 娟，高 莉，霍仕霞，等.類葉升麻苷對東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用［J］.中國中藥雜志，2012，37（19）：2956-2959.

［4］樸景華，蒲小平，馬 建，等.類葉升麻苷對東莨菪堿所致記憶獲得性障礙的改善作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2001，17（6）：625-627.

［5］He J，Hu X P，Zeng Y，etal.Advanced on acteoside for chemistry and bioactivities［J］.J Asian Nat Prod Res，2011，13（5）：449-464.

［6］白 鵬，彭曉明，高 莉，等.類葉升麻苷對岡田酸誘導(dǎo)的A1zheimer病細(xì)胞模型的保護(hù)作用研究［J］.中國中藥雜志，2013，38（9）：39-41.

［7］Huang SL，He X J，Li Z F，et al.Neuroprotective effects of ginsenoside Rg1on oxygen-g1ucose deprivation reperfusion in PC12 ce11s［J］.Pharmazie，2014，69（3）：208-211.

［8］彭 熠.ICAM-5在缺氧缺糖神經(jīng)元模型中的表達(dá)［D］.長沙：中南大學(xué)，2009.

［9］Liu Z J，Liu H Q，Xiao C，et al.Curcumin protects neurons against oxygen-g1ucose deprivation/reoxygenation-induced injury through activation of peroxisome pro1iferator-activated receptor-γ function［J］.JNeurosci Res，2014，ID：24975470.

［10］劉 娜，左萍萍，周 凱，等.連二亞硫酸鈉致PC12和NG108-15細(xì)胞擬缺血損傷研究［J］.中國藥理學(xué)通報，1998，14（6）：525-529.

［11］Erkinjuntti T，Roman G，Gauthier S，et al.Emerging the rapies for vascu1ar demeatia and vascu1ar cognitive impairment［J］.Stroke，2004，35（4）：1010-1017.

［12］Wa11in A，Sjogren M，B1ennow K，et al.Decreased cerebrospina1 f1uid acety1cho1inesterase in patients with subcortica1 ischcmic vascu1ar dementia［J］.Dement Geraatr Cogn Ddsord，2003，16（4）：200-207.

［13］賈建平，賈健民，周衛(wèi)東，等.阿爾茨海默病和血管性癡呆患者腦脊液中乙酰膽堿和膽堿檢測及其臨床意義［J］.中華神經(jīng)科雜志，2002，35（3）：168-170.

［14］鄧 云，馬百平，叢玉文，等.知母皂苷BⅡ?qū)β25-35誘導(dǎo)的原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（2）：244-247.

［15］趙金浩.強(qiáng)效乙酰膽堿酯酶抑制劑土霉素Territrem+B類似物的合成與生物活性研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2001.

R966

B

1001-1528（2015）08-1821-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.042

2015-05-20

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目 （201491174）

高 莉（1980—），女，博士，副研究員，主要從事中藥新藥篩選研究。E-mai1：gao1i-535@163.com

*通信作者：閆 明（1959—），男，碩士，研究員，主要從事創(chuàng)新藥研究。E-mai1：yanming21cn@sohu.com