李愛華, 李 倩, 白桂春, 朱世純, 李寶麗, 周春美
(1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北唐山063004;2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心,河北唐山063000;3.豐潤區(qū)人民醫(yī)院,河北唐山063000;4.唐山市協(xié)和醫(yī)院,河北唐山063004)
參附注射液預(yù)處理對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
李愛華1, 李 倩2*, 白桂春1, 朱世純3, 李寶麗4, 周春美1
(1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北唐山063004;2.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心,河北唐山063000;3.豐潤區(qū)人民醫(yī)院,河北唐山063000;4.唐山市協(xié)和醫(yī)院,河北唐山063004)
目的觀察參附注射液預(yù)處理大鼠發(fā)生腦缺血再灌注時其神經(jīng)功能、梗死腦組織體積、形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)等方面的變化,探討參附注射液預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法120只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,即假手術(shù)組,缺血再灌注組 (模型組),參附注射液預(yù)處理高、中、低劑量組 (腹腔注射給藥7 d,每天1次,第7天腹腔注射2 h后制作模型;給藥劑量分別為20、10、5 mg/kg)。采用線栓法制作大腦中動脈缺血2 h再灌注模型,Longa 5分制評分評價大鼠行為學(xué)改變,TTC染色法檢測腦梗死體積,再灌注24 h電鏡觀察缺血邊緣區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果與假手術(shù)組對比,模型組大鼠腦組織梗死體積增大,差異有顯著性 (均P<0.05);與模型組對比,參附注射液預(yù)處理各組大鼠腦梗死體積均呈現(xiàn)不同程度的減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05,或P<0.01);電鏡下,參附注射液預(yù)處理組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組明顯減輕,以高劑量組效果最為明顯。結(jié)論參附注射液預(yù)處理對大鼠急性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。
腦缺血再灌注損傷;參附注射液預(yù)處理;大鼠MCAO模型
缺血性腦血管病是導(dǎo)致老年人死亡和致殘的重要原因之一。目前,對抗缺血再灌注損傷是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但在治療上仍未取得重大突破。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過物理、化學(xué)或藥物性預(yù)處理方法可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受,這一發(fā)現(xiàn)為缺血性腦血管病的治療開拓了新方向[1]。參附注射液是由中醫(yī)著名古方參附湯加工提煉而成,為紅參和黑附片的提取物,主要藥理成分為人參皂苷和烏頭類生物堿[2]。人參皂苷對腦缺血性損傷的保護(hù)作用已有報道[3-6],而參附注射液預(yù)處理能否減輕腦缺血再灌注損傷,這方面的研究較少。本課題通過對大鼠進(jìn)行參附注射液預(yù)處理干預(yù),行大腦中動脈阻斷(midd1e cerebra1artery occ1usion,MCAO)再灌注模型,觀察大鼠神經(jīng)功能、梗死腦組織體積及其形態(tài)學(xué)與超微結(jié)構(gòu)改變,探討參附注射液預(yù)處理能否誘導(dǎo)腦缺血耐受并對大鼠急性腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。
1.1 動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠120只,體質(zhì)量250~350 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號SCXK(京)2010-0013,在屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng),1周后進(jìn)入實驗。將大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、缺血再灌注組 (模型組)、參附注射液預(yù)處理高、中、低劑量組,每組各24只大鼠。
1.2 藥物、試劑和儀器 參附注射液,三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn) (國藥準(zhǔn)字Z51020664);紅四氮唑 (TTC)染色劑(Sigma公司);透射電子顯微鏡 (日立H-7650,河北聯(lián)合大學(xué)電鏡室)。
1.3 給藥方法 參附注射液預(yù)處理高、中、低劑量組腹腔注射給藥 (給藥劑量:高劑量組20 mg/kg、中劑量組10 mg/kg、低劑量組5 mg/kg),每日1次,術(shù)前給藥7 d,末次給藥2 h內(nèi)進(jìn)行模型制作,術(shù)后停藥。假手術(shù)組及模型組給予同容量生理鹽水腹腔注射。
1.4 模型制備 術(shù)前禁食12 h,不禁水。以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,用烤燈維持體溫37.0~37.5℃,體溫由肛溫探頭連接多功能監(jiān)測儀 (Space1ab,USA)監(jiān)測。大腦中動脈阻斷 (MCAO)再灌注模型制作參照曹勇軍等改進(jìn)的Longa線栓法[7-8]:大鼠取仰臥位,頸部正中行縱行切口 (長約25.0 mm),剝離右側(cè)頸總動脈(CCA)及頸外動脈(ECA),結(jié)扎CCA近心端和ECA分叉部并反向拉直ECA,距CCA末端約5 mm處剪口,用做好的線栓 (直徑0.26mm的魚線,一端用酒精燈燒成光滑的圓頭)插入頸內(nèi)動脈 (ICA)約計 (18.5±0.5)mm,有輕微阻力即止,于ICA近心端結(jié)扎固定。2 h后,麻醉狀態(tài)下抽出魚線10mm行再灌注。假手術(shù)組大鼠實驗步驟同上,但該組大鼠不發(fā)生大腦中動脈栓塞,故插入線栓的長度不超過9 mm。成功模型判定標(biāo)準(zhǔn):大鼠左側(cè)肢體癱瘓無力,站立不穩(wěn),提尾時左側(cè)前爪抱爪。
1.5 神經(jīng)功能行為學(xué)評分 再灌注24 h后觀察各組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失表現(xiàn),并參照Zea Longa[7]5分法進(jìn)行評分:無任何神經(jīng)功能缺損為0分;左前爪不能伸直抱于胸前為1分;行走時身體以左側(cè)為圓心轉(zhuǎn)圈為2分;身體向左側(cè)傾斜為3分;不能自發(fā)行走,意識喪失為4分。1~3分可進(jìn)入后續(xù)試驗,死亡、0分及4分者均剔除,隨機(jī)補(bǔ)充,保證每組的數(shù)量不變。
1.6 大鼠腦組織梗死體積測定 缺血再灌注24 h后,各組大鼠隨機(jī)選取6只,麻醉后快速斷頭取腦,冰箱中冷凍0.5 h后,切除低位腦干、嗅球及小腦后,從額極至枕極以2 mm間隔連續(xù)切取5個冠狀腦片,并立即置于2%TTC磷酸緩沖液中,避光,37℃恒溫孵育30 min后,用4%多聚甲醛液固定2 h。正常腦組織染色后呈紅色,而梗死腦組織呈白色。數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像,采用圖像分析軟件AUTOCAD 2000系統(tǒng)進(jìn)行分析,用損傷對側(cè)半球的面積減去損傷側(cè)TTC染色正常的面積,即為梗死面積,將全部腦片梗死面積之和乘以腦片的厚度即得出梗死體積,并計算腦梗死體積占全腦的百分率[9]。
1.7 光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腦組織病理學(xué)改變 缺血再灌注24 h后,各組大鼠隨機(jī)選取6只,麻醉狀態(tài)下開胸暴露心臟,先后分別用150mL生理鹽水及200mL 4%多聚甲醛磷酸緩沖液進(jìn)行心臟灌流,斷頭取腦,甲醛固定,石蠟包埋,切片 (以前囟部位為中心沿冠狀面向后連續(xù)切取3張,片厚3~5μm),HE染色,應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理變化。
1.8 透射電鏡觀察大鼠腦組織海馬區(qū)的超微結(jié)構(gòu)改變 從各組隨機(jī)選取缺血再灌注24 h大鼠各6只并麻醉,斷頭取出腦組織置于冰盒上,快速于右側(cè)海馬CA1區(qū)取腦組織(約0.5~1 mm3大?。?%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定,經(jīng)梯度丙酮脫水、Epon-812樹脂包埋、切片、載網(wǎng)、染色后,置于電鏡下觀察腦組織的超微結(jié)構(gòu)變化并留取圖像。
2.1 大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分 假手術(shù)組大鼠未顯示出神經(jīng)功能受損癥狀,模型組大鼠神經(jīng)功能受損癥狀明顯;較之于模型組,參附注射液預(yù)處理各組大鼠神經(jīng)功能受損癥狀呈現(xiàn)不同程度的改善 (P<0.01,或P<0.05),高劑量組效果最好,具體見表1。
2.2 大鼠腦梗死體積測定結(jié)果 大腦中動脈血流被阻斷后,大鼠腦組織缺血梗死,主要累及部位是基底節(jié)和皮層。肉眼觀察,模型組大鼠梗死部位腦組織水腫,顏色蒼白,比健側(cè)體積增大,腦組織溝回變平、變淺。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織體積增大,差異顯著 (P<0.05);與模型組比較,參附注射液預(yù)處理組大鼠腦組織梗死體積有不同程度減少,差異顯著 (P<0.01,或P<0.05),高劑量組效果最為明顯,具體見表1。
表1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分及腦梗死體積比較(,n=6)
表1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分及腦梗死體積比較(,n=6)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.01,△△P<0.05
組別 劑量/(mg·kg-1)神經(jīng)功能行為學(xué)評分腦梗死體積/ % 0.00 0.00模型組 - 2.57±0.42* 24±0.05*參附注射液預(yù)處理組 20 1.66±0.43△ 11±0.01△10 1.79±0.68△△ 16±0.03△△5 2.03±0.55△△ 19±0.04假手術(shù)組-△△
2.3 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織細(xì)胞層次分明,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)無水腫,胞漿豐富,胞核大而圓,核仁清晰 (圖1A);模型組大鼠梗死側(cè)海馬CA1區(qū)腦組織,神經(jīng)元排列紊亂且數(shù)量顯著減少,胞體腫脹變大,胞質(zhì)呈空泡樣疏松化,胞核固縮、深染,甚至溶解、消失 (圖1B)。與模型組相比,參附注射液預(yù)處理各組大鼠梗死側(cè)海馬CA1區(qū)正常形態(tài)的神經(jīng)元明顯增多,僅有部分神經(jīng)元發(fā)生變性,細(xì)胞間隙無明顯變化,水腫減輕,胞漿輕度深染,核固縮,核仁消失者少見,上述變化在高劑量組體現(xiàn)最為明顯 (圖1C、D、E)。
圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織病理改變 (HE,×200)
2.4 透射電鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰完整;胞核大而圓,核膜完整,染色質(zhì)均勻分布在核內(nèi),電子透明度高;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,線粒體呈圓形或棒槌形,內(nèi)嵴多且清晰,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布;未見凋亡細(xì)胞 (圖2A)。模型組:神經(jīng)元正常形態(tài)結(jié)構(gòu)基本消失,外形不規(guī)則;胞核變形,核膜有缺損,核內(nèi)異染色質(zhì)增多,染色質(zhì)聚集靠邊;細(xì)胞器減少,結(jié)構(gòu)模糊,線粒體嵴斷裂、減少、甚至消失 (圖2B)。參附注射液預(yù)處理組:與模型組對比,可見大鼠腦組織部分神經(jīng)元變性;胞核皺縮不明顯,染色質(zhì)輕度聚集,核仁存在,水腫減輕;線粒體膜大部分完整或僅有輕微結(jié)構(gòu)改變,腫脹減輕,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整或僅輕度腫脹擴(kuò)張。以高劑量組效果最為明顯(圖2C、D、E)。
圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織超微結(jié)構(gòu) (透射電鏡,×18 000)
缺血性腦血管病由于腦血流供應(yīng)障礙引起腦組織缺血、缺氧,導(dǎo)致局域性腦組織壞死或腦軟化,其中腦缺血再灌注損傷是其重要的病理生理機(jī)制之一。近年來,有研究顯示,中藥對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,其抗損傷作用通過多個途徑、多個作用靶點(diǎn)來實現(xiàn)[10]。
參附注射液由紅參和黑附片提取而出,紅參含有12種常見人參皂苷和10種稀有人參皂苷,附子提取物中主要含有6種烏頭類生物堿[11]。有研究顯示,紅參中的主要有效成分人參皂苷,可以改善微循環(huán),具有減少氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)和阻止鈣離子內(nèi)流等多種作用[12]。亦有研究提示,人參皂苷在使Bc1-2表達(dá)增強(qiáng)的同時使Caspase-3表達(dá)減弱,由此起到抑制凋亡作用[13]。近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),稀有人參皂苷Rg3對腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[14],且稀有人參皂苷的抗氧化能力和清除自由基能力比常見人參皂苷更強(qiáng)[15]。
本課題通過建立MCAO再灌注模型探討參附注射液預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用,結(jié)果顯示參附注射液可使缺血再灌注大鼠腦梗死面積明顯縮小,神經(jīng)功能缺失癥狀出現(xiàn)明顯的改善,均提示該藥對缺血再灌注腦組織具有保護(hù)作用。
光鏡下,模型組大鼠梗死側(cè)海馬CA1區(qū)腦組織排列紊亂、間隙增寬,細(xì)胞腫脹明顯,胞核固縮、深染,甚至溶解、消失。投射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),模型組梗死側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元外形不規(guī)則;胞核變形核內(nèi)異染色質(zhì)增多,染色質(zhì)聚集靠邊;細(xì)胞器減少,線粒體嵴斷裂、減少、甚至消失;形成特征性的凋亡小體,參附注射液預(yù)處理組大鼠腦組織的改變與模型組對比,均明顯減輕。研究結(jié)果證明參附注射液預(yù)處理具有減輕缺血再灌注腦組織神經(jīng)功能損傷的作用。
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R285.5
B
1001-1528(2015)08-1818-03
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.041
2014-10-11
河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項目 (132777218);唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項目 (12130268b)
李愛華 (1977—),女,碩士,講師/主治醫(yī)師,主要從事腦血管病基礎(chǔ)研究與臨床研究。Te1:15127577896,E-mai1:865906446@qq.com
*通信作者:李 倩 (1977—),女,講師,從事腦血管病基礎(chǔ)研究。Te1:15532585160,E-mai1:340154235@qq.com