青防腫痛外敷散對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型家兔的影響

郭玉巖， 呂邵娃， 王 銳， 孫 爽， 孟令超， 李永吉

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

青防腫痛外敷散對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型家兔的影響

郭玉巖， 呂邵娃， 王 銳， 孫 爽， 孟令超， 李永吉*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

目的探討青防腫痛外敷散抗炎及對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎家兔的治療作用。方法采用大鼠足腫脹法和棉球肉芽腫試驗(yàn)，觀察其抗炎作用。關(guān)節(jié)制動(dòng)法制備家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，采用青防腫痛外敷散高、中、低劑量及陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行干預(yù)，觀察給藥前后家兔關(guān)節(jié)形態(tài)、血清中超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛 （MDA）的變化及其關(guān)節(jié)病理改變情況。結(jié)果青防腫痛外敷散高、中、低劑量組對(duì)大鼠足腫脹度4 h達(dá)到最大抑制，有效降低棉球肉芽腫。正、側(cè)位CR片顯示青防腫痛外敷散有效改善關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)，血清中SOD和MDA變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），可明顯改善家兔膝關(guān)節(jié)的病理變化。結(jié)論青防腫痛外敷散有抗炎作用；可改善膝關(guān)節(jié)軟骨宏觀和微觀形態(tài)，對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有治療作用。

青防腫痛外敷散；膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎；藥效學(xué)

青風(fēng)藤為防己科植物青藤或毛青藤等的干燥藤莖，始載于宋代 《圖經(jīng)本草》［1-3］，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利水止痛等功效，中醫(yī)用其治療風(fēng)濕性疾病已有1千多年的歷史［4-5］；防己為防己科多年生木質(zhì)藤本植物粉防己的干燥根，也具有祛風(fēng)濕、止痛、利水消腫的功效［6］，經(jīng)典方劑常將二者相須為用，治療風(fēng)濕痹痛。課題組以青風(fēng)藤和防己為主藥，經(jīng)提取精制后，加適宜輔料制備而成的青防腫痛外敷散，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功效，用于膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕痹阻癥治療。本實(shí)驗(yàn)在前期研究工作基礎(chǔ)上對(duì)青防腫痛外敷散進(jìn)行了抗炎作用研究，并建立特異性動(dòng)物模型［7-9］，考察其對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的影響。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Digita1 Diagnost直接數(shù)字化成像系統(tǒng)（飛利浦公司）；FJ-2003PS放射免疫計(jì)數(shù)儀 （西安二六二廠）；FA2004分析電子天平 （上海良平儀器儀表有限公司）。

TGL—16C臺(tái)式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；人超氧化物歧化酶 （SOD）ELISA試劑盒 （上海信裕生物科技有限公司）；人丙二醛 （MDA）ELISA試劑盒 （上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）；角叉菜膠 （Sigma公司）。

1.2 藥品 青防腫痛外敷散（QF-WFS，哈爾濱怡康藥業(yè)有限公司，20130402）；芎芷痛瘀散 （河北神達(dá)藥業(yè)有限公司，130205）。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量150～200 g，清潔級(jí)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證為SCXK黑2008004。

新西蘭大白兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK（吉）2008-0004。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

2.1.1 大鼠抗炎試驗(yàn) 棉球肉芽腫試驗(yàn)，W istar大鼠分5組，每組10只。各組分別為：芎芷痛瘀散組 （0.720 g/kg）、青防腫痛外敷散高劑量組 （2.430 g/kg）、青防腫痛外敷散中劑量組 （1.215 g/kg）、青防腫痛外敷散低劑量組 （0.405 g/kg）和對(duì)照組 （無(wú)刺激性膠布）。角叉菜膠致足腫脹試驗(yàn)分5組，各組與棉球肉芽腫試驗(yàn)相同，另增加模型組。各給藥組試驗(yàn)貼敷給藥，每日一次。

2.1.2 家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎試驗(yàn) 新西蘭家兔隨機(jī)分為6組，每組8只。按動(dòng)物與人體折算系數(shù)表折算，采用按體質(zhì)量與按給藥面積相結(jié)合的方法設(shè)計(jì)給藥量，分別為芎芷痛瘀散組（0.373 g/kg，9.30 cm2/只）、青防腫痛外敷散高劑量組（1.260 g/kg，28.05 cm2/只）、青防腫痛外敷散中劑量組（0.630 g/kg，14.00 cm2/只）、青防腫痛外敷散低劑量組（0.210 g/kg，4.67 cm2/只）、模型組及對(duì)照組。將各給藥組家兔膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，涂少量水后，將藥物貼敷于關(guān)節(jié)處，用保鮮膜包裹，青防腫痛外敷散高、中、低劑量組每天換一次藥。芎芷痛瘀散組每5天換一次藥。

2.2 大鼠足腫脹模型 分組與給藥同 “2.1.1”項(xiàng)。末次給藥前，采用排體積法先測(cè)量每鼠正常足跖容積，連續(xù)給藥4 d，于末次給藥0.5 h后，將大鼠左后足底皮下注射1%角叉菜膠 （0.1 mL/只），致炎后分別在0.5、1、2、4和6 h測(cè)定其足跖容積，以觀察足跖腫脹程度。

2.3 棉球肉芽腫模型 分組與給藥同 “2.1.1”項(xiàng)。取各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，在左前肢腋下切開小口，用眼科鑷將已經(jīng)稱定約為20 mg的滅菌棉球從切口植

2.4 家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型 分組與給藥同 “2.1.2”項(xiàng)，將實(shí)驗(yàn)家兔左膝于腹股溝以下1.5 cm至踝關(guān)節(jié)下3 cm（趾端），伸直位石膏固定，關(guān)節(jié)制動(dòng)2周后各給藥組開始給藥。給藥前需將各給藥組家兔膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，涂少量水后，將藥物貼敷于關(guān)節(jié)處，用保鮮膜包裹，再用管型石膏繼續(xù)固定4周。給藥期間觀察各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)情況。制動(dòng)6周后，10%水合氯醛耳緣靜脈注射將家兔麻醉，進(jìn)行X線片拍攝，觀察有無(wú)骨贅增生、關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)軟骨下骨硬化及有無(wú)關(guān)節(jié)變形；取后肢隱靜脈血，離心后取血清，采用酶聯(lián)免疫法 （ELISA）檢測(cè)SOD和MDA的值［10-11］；動(dòng)物處死，切開造模膝關(guān)節(jié)，大體觀察膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及滑膜情況；取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本HE染色，光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 大鼠足腫脹試驗(yàn) 結(jié)果見表1。青防腫痛外敷散各給藥組同模型組相比，均能抑制大鼠足腫脹，而且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，表明青防腫痛外敷散具有明顯的抑制角叉菜膠所致的大鼠足腫脹的作用。

表1 青防腫痛外敷散對(duì)大鼠足腫脹的影響 （，n=10）

表1 青防腫痛外敷散對(duì)大鼠足腫脹的影響 （，n=10）

注：各組均與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1）致炎后足腫脹度/% 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h青防腫痛外敷散組 2.430 15.8±5.1* 23.0±4.8** 28.3±4.5** 19.6±5.2** 15.3±4.8**青防腫痛外敷散組 1.215 16.5±6.0* 23.7±5.8* 29.7±7.2** 24.0±7.1** 17.8±5.0**青防腫痛外敷散組 0.405 17.0±4.6* 24.2±5.5* 31.0±7.4** 26.3±7.2** 20.7±5.9**芎芷痛瘀散組 0.720 16.3±6.2* 22.7±5.7** 28.5±6.3** 23.8±6.1** 19.1±5.0**模型組 —22.8±7.4 33.4±9.8 43.5±7.3 37.5±6.9 31.8±7.5

3.2 棉球肉芽腫試驗(yàn) 結(jié)果見表2。青防腫痛外敷散高、中、低劑量組試驗(yàn)結(jié)果均小于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明青防腫痛外敷散能夠抑制肉芽的生長(zhǎng)，對(duì)由棉球刺激引起的炎癥具有治療作用。

表2 青防腫痛外敷散對(duì)棉球肉芽腫的影響（，n=10）

表2 青防腫痛外敷散對(duì)棉球肉芽腫的影響（，n=10）

注：各組均與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1）肉芽干質(zhì)量/mg 抑制率/%青防腫痛外敷散組 2.430 20.5±7.1**52.7青防腫痛外敷散組 1.215 25.0±8.6** 42.4青防腫痛外敷散組 0.405 28.0±6.0** 35.4芎芷痛瘀散組 0.720 23.3±5.7** 46.3模型組- 43.4±10.0 -

3.3 家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型試驗(yàn)

3.3.1 家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型建立的評(píng)價(jià) 關(guān)節(jié)制動(dòng)法造模6周后，實(shí)驗(yàn)家兔出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵直、跛足的情況，影像學(xué)觀察，模型組家兔骨關(guān)節(jié)都有不同程度的退變，關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)軟骨下骨硬化及關(guān)節(jié)變形和有骨贅增生，表明家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型造模成功。

3.3.2 血清中SOD和MDA的變化 結(jié)果見表3。由表結(jié)果可知，空白組的SOD水平高于模型組，MDA水平低于模型，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該模型會(huì)降低家兔血清中SOD濃度，升高血清中MDA濃度，破壞免疫系統(tǒng)的正常功能。青防腫痛外敷散高、中劑量組SOD水平高于模型組、MDA水平低于模型組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明，青防腫痛外敷散能夠提高模型家兔的免疫能力，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能。

表3 青防腫痛外敷散組對(duì)血清中MDA、SOD的影響（，n=8）

表3 青防腫痛外敷散組對(duì)血清中MDA、SOD的影響（，n=8）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1，cm2/只） SOD/（μmo1·mL-1） MDA/（nmo1·mL-1）空白組 —312.69±22.17 2.51±0.74模型組 — 225.16±24.31a 3.87±0.45a青防腫痛外敷散組 1.260，28.05 307.59±20.26b 2.59±0.40b青防腫痛外敷散組 0.630，14.00 282.90±29.74a、b 2.91±0.53b青防腫痛外敷散組 0.210，4.67 260.50±18.76a 3.20±0.60芎芷痛瘀散組 0.373，9.30 283.85±37.01b3.23±0.65

3.4 膝關(guān)節(jié)影像學(xué)觀察結(jié)果 結(jié)果見圖1。由圖1結(jié)果可知，模型組家兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙發(fā)生變化，外側(cè)間隙增大，內(nèi)側(cè)間隙明顯狹窄，關(guān)節(jié)失穩(wěn)；關(guān)節(jié)面硬化、不光整、粗糙變形，關(guān)節(jié)邊緣有明顯骨贅；青防腫痛外敷散低劑量組關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄，外側(cè)間隙稍寬，關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成，關(guān)節(jié)面粗糙變形、有輕微的硬化；青防腫痛外敷散高劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙稍變窄，關(guān)節(jié)面輕微硬化，與模型組比較關(guān)節(jié)面尚光整，未見明顯骨贅形成；青防腫痛外敷散中劑量組動(dòng)物表現(xiàn)介于受試物高、低劑量組之間，與模型組動(dòng)物比較有明顯改善。

圖1 青防腫痛外敷散對(duì)膝關(guān)節(jié)影像學(xué)影響結(jié)果圖

3.5 膝關(guān)節(jié)光鏡觀察結(jié)果 結(jié)果見圖2。由圖2結(jié)果可見模型組膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)裂隙，軟骨缺損區(qū)，軟骨變薄，表淺層細(xì)胞消失，移形層細(xì)胞部分消失，存在軟骨細(xì)胞簇聚現(xiàn)象，放射層細(xì)胞簇聚現(xiàn)象，核萎縮，潮標(biāo)線不完整。裂隙周圍可見脫水固縮壞死的軟骨細(xì)胞，靠近表層有較多囊性改變，軟骨細(xì)胞排列紊亂，4層結(jié)構(gòu)不易分辮。青防腫痛外敷散低劑量組膝關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨有裂隙，有較小軟骨缺損區(qū)，表淺層缺失，細(xì)胞大部分消失，移形層與放射層軟骨細(xì)胞簇聚現(xiàn)象，潮標(biāo)線稍不完整，可見軟骨細(xì)胞增生。青防腫痛外敷散中劑量組膝關(guān)節(jié)軟骨膜光滑，表面無(wú)裂隙，無(wú)潰爛，細(xì)胞數(shù)量一般，細(xì)胞形態(tài)類圓形。細(xì)胞排列欠規(guī)則，潮線尚完整。青防腫痛外敷散高劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軟骨膜光滑，表面無(wú)裂隙、無(wú)潰爛，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)較圓而大，排列正常，但細(xì)胞核略長(zhǎng)，潮標(biāo)線尚完整。

圖2 青防腫痛外敷散對(duì)膝關(guān)節(jié)病理影響組織切片圖

4 討論

局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及其炎性細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生是引起炎癥反應(yīng)的重要因素，炎性因子不僅是炎癥細(xì)胞的產(chǎn)物，而且反過來(lái)影響炎癥細(xì)胞，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重病情。青防腫痛外敷散對(duì)大鼠足腫脹和棉球肉芽腫均顯示較強(qiáng)的抑制作用，其原因可能為主要有效成分青藤堿能夠抑制前列腺素 （PGE2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，起到抗炎的作用，其確切的作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步深入研究。

家兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型得制備有多種方法，包括手術(shù)法、固定法以及關(guān)節(jié)腔注射法，其中最常用的為手術(shù)法［12］。但由于本實(shí)驗(yàn)試藥為外敷用散劑，在手術(shù)法造模部位進(jìn)行給藥極易引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染，因此，在成功預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本文采用固定法制備膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。模型建立中影像學(xué)觀察兔膝關(guān)節(jié)外側(cè)間隙增大，內(nèi)側(cè)間隙明顯狹窄，關(guān)節(jié)失穩(wěn)，關(guān)節(jié)邊緣有明顯骨贅形成，說(shuō)明造模成功。

MDA和SOD是反應(yīng)氧自由基的水平和氧自由基清除能力的主要指標(biāo)，SOD活力大小可反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA水平可反應(yīng)氧自由基水平的變化［13-14］。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)時(shí)模型動(dòng)物血清中SOD活力降低，MDA水平升高，表明SOD和MDA與膝關(guān)節(jié)炎病變的程度呈負(fù)相關(guān)。青防腫痛外敷散高、中劑量可有效提高血清中SOD活力和降低MDA水平，分析其作用機(jī)制可能為通過提高SOD的活力來(lái)清除機(jī)體多余自由基，抑制氧自由基對(duì)軟骨細(xì)胞的損害，從而達(dá)到保護(hù)軟骨及其基質(zhì)免受氧自由基侵害的作用，進(jìn)而延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，發(fā)揮治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）08-1810-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.039

2014-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81373929）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81473359）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)新藥基金（X200903）；黑龍江省自然科學(xué)基金 （H201472）

郭玉巖（1982—），碩士，講師，從事中藥新藥開發(fā)研究。Te1：13845046561，E-mai1：guoyuyan622@163.com

*通信作者：李永吉（1957—），教授，醫(yī)學(xué)博士，從事新藥制劑技術(shù)開發(fā)。E-mai1：1iyongji2009@163.com