黔產(chǎn)寬葉纈草的RAPD分析

錢志瑤， 周 鎂， 黃秀平， 周道堂， 覃容貴

（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550004）

黔產(chǎn)寬葉纈草的RAPD分析

錢志瑤， 周 鎂， 黃秀平， 周道堂， 覃容貴*

（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550004）

目的探討黔產(chǎn)寬葉纈草在分子水平上的遺傳多樣性。方法試劑盒法提取20份寬葉纈草樣本的總DNA，擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)從40個(gè)隨機(jī)引物中篩選出13個(gè)，對(duì)總DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，Popgene 1.32和NTSYS 2.10e軟件分析樣本的Nei's、Shannon's多樣性指數(shù)以及Jaccard遺傳相似性系數(shù)，UPGMA法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果20份寬葉纈草樣本中共擴(kuò)增出102條清晰條帶，其中88條具有多態(tài)性，多態(tài)率為86.27%，Nei's和Shannon's多樣性指數(shù)分別為0.303 0和0.453 7，Jaccard遺傳相似系數(shù)在0.411 8～0.882 4之間。另外，UPGMA聚類分析可將來自劍河縣的13份樣本聚為一類，江口縣的7份樣本聚為另一類，而且劍河地區(qū)又分為栽培與野生樣本2個(gè)分支。結(jié)論黔產(chǎn)寬葉纈草種水平上具有較高的遺傳多樣性，其RAPD標(biāo)記可用于遺傳多樣性研究，為今后開發(fā)該植物的選種與育種工作奠定基礎(chǔ)。

寬葉纈草；RAPD；遺傳多樣性；聚類分析

寬葉纈草Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq為敗醬科纈草屬下的一個(gè)變種，在我國主要分布在貴州、四川、云南等地區(qū)［1］。它具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁、調(diào)血脂及抗脂質(zhì)過氧化等活性，并對(duì)腎臟有保護(hù)作用，另外也可治療膽囊結(jié)石和心腦血管系統(tǒng)疾病，還常用作鎮(zhèn)靜劑和香精香料，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。貴州是寬葉纈草產(chǎn)量較大的地區(qū)之一，種植面積達(dá)到50 000畝以上，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)厥种匾漠a(chǎn)業(yè)［3-5］。然而，目前黔產(chǎn)寬葉纈草普遍存在品種退化、產(chǎn)品附加值低、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱等問題，嚴(yán)重制約了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為了避免該藥用植物枯竭，勢(shì)必要進(jìn)行藥材的規(guī)范化栽培種植（GAP）［6］，這不但能從遺傳學(xué)角度觀察引起寬葉纈草品種退化的原因，也可為其栽培種植提供理論指導(dǎo)。

RAPD（random amp1ified po1ymorphic DNA）全名隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)，通過使用一系列具有10個(gè)堿基的單鏈隨機(jī)引物，可對(duì)基因組全部DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增來檢測(cè)其多態(tài)性［7］。為了更好地開發(fā)利用寬葉纈草這一優(yōu)良的中藥資源，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該技術(shù)對(duì)其進(jìn)行初步研究，為今后進(jìn)行該植物的種植育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 寬葉纈草大部分采自貴州省江口苗藥生物科技有限公司劍河和江口種植基地，其余為劍河野生，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院龍慶德教授鑒定為敗醬科纈草屬植物寬葉纈草Valeriana officinalis L.var. 1atifolia Miq。然后，選擇全株植物上的幼嫩葉片作為提取基因組DNA的材料，-20℃下保存，樣本編號(hào)和采集地點(diǎn)，見表1。

表1 樣本來源Tab.1 Sources of samples

1.2 儀器 TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XH-B漩渦混合器 （江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）；BIOMATE 3S核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；S1000PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（香港基因有限公司）。

1.3 試劑和引物 DL2000 DNA Marker、DP-320新型植物基因組DNA高效提取試劑盒 （北京天根生化科技有限公司）；Taq酶、dNTP Mixture、Mg2+、Go1dViewⅠ核酸染色劑、10×buffer、50× TAE緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；RAPD隨機(jī)引物 （上海捷瑞生物工程有限公司）；西班牙瓊脂糖 （香港基因有限公司）。所用試劑均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 按照DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行提取，然后將提取后的基因組DNA在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)完整性，并用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度［8］。

2.2 RAPD擴(kuò)增反應(yīng) 擴(kuò)增反應(yīng)體系在25μL體積中進(jìn)行。其中，10×Buffer 2.5μL、Mg2+（25 mmo1/L）4μL、dNTPMixture（10 mmo1/L）1μL、Taq酶（5U）0.4μL、引物（50μmo1/L）2μL、模板濃度為60 ng，加ddH2O至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃下預(yù)變性3 min，然后94℃下變性1 min，34℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃下延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，置于含1×TAE緩沖液的1.8%瓊脂糖凝膠上，Go1dViewⅠ核酸染色劑染色，100 V恒壓下電泳30 min，DNA Marker DL2000分子標(biāo)記，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2.3 引物篩選 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用40條10個(gè)堿基長度的寡核苷酸隨機(jī)引物，對(duì)上述提取后的樣本基因組DNA進(jìn)行RAPD預(yù)擴(kuò)增，從中篩選出有多態(tài)性、條帶清晰、重復(fù)性好的引物［9］。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 選取各樣本擴(kuò)增重復(fù)性好的條帶（包括亮帶和可識(shí)別的暗帶）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳中遷移率相同的條帶可被認(rèn)為是同源性的，有帶（包括弱帶）記為 “1”，無帶記為 “0”，得到原始1/0數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增出的總帶數(shù)和其中的多態(tài)性帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性帶百分率 （percentage of po1ymorphicbands，PPB，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)）。然后，Popgene1.32軟件計(jì)算Nei's多樣性指數(shù)（h）和Shannon's多樣性指數(shù)（I），NTSYS2.10e軟件計(jì)算各樣本間Jaccard遺傳相似性系數(shù)（genetic simi1arity，GS），并獲得遺傳相似系數(shù)矩陣，再使用不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法 （Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Average，UPGMA），以遺傳相似系數(shù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)樹圖［10-13］。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA的提取結(jié)果 采用試劑盒所提取的基因組DNA溶液無色透明，無黏稠現(xiàn)象，而且電泳條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，基因組DNA片段大小一致，說明提取較完整，見圖1。樣本基因組DNA濃度在20～50 ng/μL之間，OD260/280值在1.7～2.0之間，表明蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的除去比較干凈。依據(jù)各樣本的OD260/280值，實(shí)驗(yàn)所提取的樣本DNA純度較高，質(zhì)量好，適合后續(xù)RAPD的分析。

圖1 DNA檢測(cè)電泳圖Fig.1 DNA electrophoretogram

3.2 寬葉纈草遺傳多樣性分析 本實(shí)驗(yàn)篩選出13條有效隨機(jī)引物，獲得了譜帶清晰、多態(tài)性良好的圖譜，引物序列及擴(kuò)增結(jié)果見表2。通過對(duì)20份寬葉纈草樣本基因組DNA擴(kuò)增，得到亮帶和可識(shí)別的弱帶共102條，其中共有條帶14條，多態(tài)性條帶88條，多態(tài)性比率為86.27%，每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)在5～10條之間，平均擴(kuò)增數(shù)為7.7條，多態(tài)條帶率變幅為20%～100%，部分?jǐn)U增圖譜見圖2。另外，從表3可以看出，寬葉纈草總的Nei's多樣性指數(shù)（H）和Shannon's多樣性指數(shù)（I）分別為0.303 0和0.453 7，其中在不同居群中前者的范圍在0.184 4～0.257 9之間，而后者的范圍在0.273 1～0.392 0之間，各獨(dú)立居群的遺傳多樣性均低于總體寬葉纈草，并與Shannon指數(shù)的結(jié)果完全相符。

表2 引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Tab.2 Result of primers sequences and their amplification

表3 不同種群寬葉纈草的遺傳多樣性指數(shù)Tab.3 Genetic d iversities in Valeriana officinalis L.var. latifolia M iq in different populations

3.3 遺傳聚類分析 根據(jù)13條有效隨機(jī)引物在20個(gè)樣本中所獲得的102條擴(kuò)增條帶，可計(jì)算出各樣本間的遺傳相似系數(shù) （GS值），并得出遺傳相似系數(shù)矩，見表4。結(jié)果表明，20個(gè)樣本間的GS值分布較廣，變化范圍在0.411 8～0.882 4之間，說明其遺傳背景較復(fù)雜，具有較高的遺傳多態(tài)性。其中，2號(hào)和5號(hào)樣本相似性系數(shù)最大，達(dá)0.88，說明它們的親緣關(guān)系最近?；跇颖鹃gGS值，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這20個(gè)樣本可分為兩類，劍河地區(qū)的13個(gè)樣本歸為Ⅰ類，并且栽培與野生樣本分為兩個(gè)分支，而剩余7個(gè)樣品歸為Ⅱ類。另外，當(dāng)GS值約為0.88時(shí)，可將20個(gè)寬葉纈草樣本區(qū)分。

4 討論

RAPD技術(shù)具有無需明確基因序列等特點(diǎn)，而利用一系列隨機(jī)引物則能對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，可用于各種植物的遺傳多樣性分析和品種鑒別等方面［14］。目前，該技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)便、靈敏性高、省時(shí)省力、不易受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于中藥材中，為中藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展提供了理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)意義［15］。

圖2 引物5、21、37擴(kuò)增的RAPD圖譜Fig.2 Result of PCR amp lification using 5，21 and 37 RAPD p rimers

表4 基于RAPD分析的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic sim ilarity coefficients on the basis of RAPD analysis

圖3 20份寬葉纈草樣本UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 20 Valeriana officinalis L.var.latifolia M iq sam ples

本實(shí)驗(yàn)利用RAPD技術(shù)，從DNA分子水平上分析了黔產(chǎn)寬葉纈草的的遺傳多樣性，而多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPB）、Nei's基因多樣性（H）與Shannon's基因多樣性指數(shù) （I）都是測(cè)量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)［16］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)寬葉纈草的多態(tài)性比率（PPB）為86.27%，而PPB在50%左右時(shí)即被認(rèn)為是遺傳多樣性豐富［17］，故該植物在種群水平上具有較高的遺傳多樣性。另外，由遺傳相似系數(shù)圖表可知，各樣本間的相似性系數(shù)在0.411 8～0.882 4之間，說明寬葉纈草種內(nèi)具有豐富的多態(tài)性。而且，Nei's（H）和Shannon's多樣性指數(shù) （I）統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，栽培型寬葉纈草種群間的遺傳多樣性水平差異不大，但與野生種群間存在一定的遺傳變異。研究表明［18］，RAPD標(biāo)記劃分的類型同地理分布有一定關(guān)系，地理位置較近的樣本大多能聚到一起。劍河地區(qū)的寬葉纈草大多為粗放型栽培，幾無后期田間管理，人為因素影響較小，與當(dāng)?shù)匾吧鷮捜~纈草的生長環(huán)境相似；江口地區(qū)所栽培的寬葉纈草具有一定的規(guī)范性與規(guī)模性，人為因素影響較大。在人工栽培中，人們往往對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行了有意識(shí)地選擇，篩選出較好的生產(chǎn)用種 （苗），這在一定程度上對(duì)寬葉纈草的種質(zhì)資源進(jìn)行了選種與育種。由聚類圖譜可知，各樣本可聚為兩類，第Ⅰ類包括劍河地區(qū)的兩個(gè)群居，共13個(gè)樣本，并在閾值約0.65處分為栽培與野生樣本兩個(gè)分支，而江口地區(qū)的7個(gè)樣本在閾值約0.62處聚為第Ⅱ類，總體上呈現(xiàn)地域性分布。

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RAPD analysis of Valeriana officinalis L.var.latifolia M iq collected from Guizhou Province

QIAN Zhi-yao， ZHOU Mei， HUANG Xiu-ping， ZHOU Dao-tang， QIN Rong-gui*

（College of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

AIMTo exp1ore the genetic diversity of Xiecao（Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq）co1-1ected from Guizhou Province atmo1ecu1ar 1eve1.METHODSThe extraction kitwas used to extract the genomic DNA of Xiecao samp1es，then they were amp1ified with 13 random primers screened from 40 primersby random amp1ified po1ymorphic DNA（RAPD）.The Nei's gene diversity and Shannon's information index were ca1cu1ated by Popgene 1.32，Jaccard genetic simi1arity coefficients were ca1cu1ated by NTSYS 2.10e，and c1uster ana1ysis was carried outby UPGMA method.RESULTSWith DNA amp1ification，tota11y 102 bands were amp1ified from 20 samp1es，88 of which were po1ymorphic with the po1ymorphism rate of 86.27%.The Nei's gene diversity and Shannon's information index were 0.303 0 and 0.453 7，respective1y.The Jaccard genetic simi1arity coefficients fe11between 0.411 8 and 0.882 4.The UPGMA ana1ysis c1assified 20 samp1es into 2 groups，13 samp1es from Jianhe County were c1ustered into one group，whi1e 7 samp1es from Jiangkou County were c1ustered into the other group.In additaion，the former was a1so subdivided into cu1tivated and wi1d samp1es.CONCLUSIONThere is an abundant genetic diversity in Xiecao co11ected from Guizhou Province at species 1eve1.And RAPD markers can provide the basis for the seed se1ection and breeding of this p1ant.

Xiecao（Valeriana officinalis L.var.latifolia Miq）；RAPD；genetic diversity；c1uster ana1ysis

R931.2

A

1001-1528（2015）08-1751-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.026

2014-09-16

貴州省中藥攻關(guān)項(xiàng)目 （黔科合ZY［2011］3008）；貴州省高層次人才特助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目 （TZJF-2010-053）

錢志瑤 （1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及質(zhì)量評(píng)價(jià)。Te1：15285135995，E-mai1：95661575@qq.com

*通信作者：覃容貴 （1970—），女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及質(zhì)量評(píng)價(jià)。Te1：18984114150，E-mai1：1346812934@ qq.com