HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益資生丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸

王 堅(jiān)， 徐 菁， 李 鵬， 朱 軍*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，湖北十堰442008）

HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益資生丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸

王 堅(jiān)1，2， 徐 菁1，2， 李 鵬1，2， 朱 軍1，2*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，湖北十堰442008）

目的建立高效液相同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益資生丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸成分的分析方法。方法補(bǔ)益資生丸甲醇提取，分析采用Hypersi1C18色譜柱；以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；體積流量1.2 mL/min；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，去氫土莫酸、豬苓酸C檢測(cè)波長(zhǎng)為241 nm，茯苓酸為210 nm。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸質(zhì)量濃度分別在4.12～82.40μg/mL（r=0.999 8）、6.55～131.00μg/mL（r=0.999 4）、4.30～86.00μg/mL（r=0.999 9）、5.35～107.00 μg/mL（r=0.999 2）、4.40～88.00μg/mL（r=0.999 7）時(shí)與其峰面積線性關(guān)系良好；平均加樣回收率（n=6）分別為99.0%、97.6%、99.1%、97.0%、97.9%，RSD分別為1.2%、1.6%、1.2%、0.91%、1.5%。結(jié)論暫定本品標(biāo)準(zhǔn)為每丸中含白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ不得低于0.26mg，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ不得低于0.15mg，去氫土莫酸不得低于0.40mg，豬苓酸C不得低于0.14 mg，茯苓酸不得低于0.20 mg。

補(bǔ)益資生丸；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；去氫土莫酸；豬苓酸C；茯苓酸

補(bǔ)益資生丸是由白術(shù) （麩炒）、茯苓、人參、甘草、白扁豆 （去皮）、山藥、南山楂 （炒）、六神曲 （麩炒）、麥芽、蓮子、薏苡仁 （麩炒）、芡實(shí) （麩炒）、澤瀉、豆蔻、化橘紅、廣藿香、桔梗、黃連等18味藥物組成的復(fù)方中藥制劑，處方收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第7冊(cè)［1］，為黃褐色的大蜜丸，味甘、微苦。因其具有滋陰補(bǔ)氣、調(diào)養(yǎng)脾胃的功效，近年來(lái)補(bǔ)益資生丸臨床普遍用于治療脾胃虛弱引起的胸悶作嘔、食欲不振、精神倦怠、大便溏泄等疾病，療效顯著，安全可靠。白術(shù) （麩炒）和茯苓為方中的主要藥物，原部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)個(gè)別藥材進(jìn)行了定性鑒別研究，未對(duì)方中的任何藥物進(jìn)行定量分析［1-2］，很難有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫法對(duì)補(bǔ)益資生丸中白術(shù)所含白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和茯苓所含去氫土莫酸、豬苓酸C、茯苓酸進(jìn)行定量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agi1ent 1200高效液相色譜儀，Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。

對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ （批號(hào)73030-71-4，純度為98.0%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ （批號(hào)73069-13-3，純度為98.0%）、茯苓酸 （批號(hào) 29070-92-6，純度為95.0%）購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；對(duì)照品去氫土莫酸 （批號(hào) 6754-16-1，純度為98.0%）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；對(duì)照品豬苓酸C（批號(hào)465-8-9，純度為98.0%）購(gòu)于上海莫奇生物科技有限公司。

補(bǔ)益資生丸 （6 g/丸，批號(hào)分別為2015617、2015618、2015619）購(gòu)于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。

甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸為分析純。

2 色譜條件

依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液［3-10］，梯度洗脫 （0～12 min，50.0%A；12～32 min， 50.0%→65.0%A；32～40 min，65.0%→70.0% A；40～50 min，70.0%→50.0%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)λ1=220 nm（0～22 min）［11-12］，λ2=241 nm（22～36 min）［5，13］，λ3=210 nm（36～50 min）［5］；體積流量為1.2 mL/min；進(jìn)樣量20μL。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按各組分計(jì)均不得低于3 000，分離度均大于1.5。

3 溶液的配制

3.1 混合對(duì)照品溶液配制 取5種對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸各適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.412 mg/mL、0.655 mg/mL、0.430 mg/mL、0.535 mg/mL、0.440 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液。再分別精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液2.5、1、4、1、2 mL置于同一個(gè)50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C與茯苓酸質(zhì)量濃度分別為0.020 6、0.013 1、0.034 4、0.010 7、0.017 6 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備 取本品10丸，剪碎，取約10.0 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲 （功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按補(bǔ)益資生丸處方比例，按補(bǔ)益資生丸的制備工藝［1］分別制成白術(shù)（麩炒）陰性對(duì)照樣品和茯苓陰性對(duì)照樣品，按照 “3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成白術(shù)（麩炒）陰性對(duì)照溶液和茯苓陰性對(duì)照溶液。

4 方法學(xué)考察

4.1 干擾試驗(yàn) 分別精密吸取20μL的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、白術(shù) （麩炒）陰性對(duì)照溶液及茯苓陰性對(duì)照溶液，注入液相色譜儀中，結(jié)果表明樣品中其他成分對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸的測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s

4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取 “3.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 m L，分別置于5個(gè)10mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按 “2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積Y與對(duì)照品質(zhì)量濃度X線性回歸，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回歸方程為Y=2.025×104X-304.1，r= 0.999 8，線性范圍為4.12～82.40μg/m L；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ回歸方程為Y=1.964×104X+291.2，r= 0.999 4，線性范圍為6.55～131.00μg/mL；去氫土莫酸回歸方程為Y=4.052×104X-531.7，r= 0.999 9，線性范圍為4.30～86.00μg/mL；豬苓酸C回歸方程為Y=2.041×104X+168.4，r= 0.999 2，線性范圍為5.35～107.00μg/mL；茯苓酸回歸方程為Y=2.641×104X+263.1，r= 0.999 7，線性范圍為4.40～88.00μg/mL。結(jié)果表明：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸在各自的線性范圍內(nèi)，所測(cè)組分質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得5種成分的峰面積，計(jì)算各成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD分別為0.7% （白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）、0.7% （白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）、0.5% （去氫土莫酸）、0.8% （豬苓酸C）和1.0% （茯苓酸）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)供試品，按“3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照 “2”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含有量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸的RSD分別為 0.8%、0.7%、0.5%、0.6%和0.8%。結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其峰面積值，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸的RSD分別為0.48%、0.7%、0.6%、0.5%和0.7%。表明供試品溶液24 h之內(nèi)穩(wěn)定性較好。

4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批補(bǔ)益資生丸 （批號(hào)2015617，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為0.054 mg/g、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為0.032 mg/g，去氫土莫酸為0.083 mg/g，豬苓酸C為0.029 mg/g，茯苓酸為0.042 mg/g）10丸，剪碎，取約5.0 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液13 mL和甲醇12 mL，按“3.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

5 樣品測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)的樣品，依據(jù) “3.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按照 “2”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液 （白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C與茯苓酸質(zhì)量濃度分別為0.020 6、0.013 1、0.034 4、0.010 7、0.017 6 mg/mL）各進(jìn)樣20μL，用外標(biāo)法計(jì)算本品中各組分含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of recovery tests for atractylenolideⅢ，atractylenolideⅠ，dehydrotumulosic acid，polyporenic acid C and pachym ic acid

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Resu lts of determ ination

6 討論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫時(shí)色譜峰分離較好，分離度均大于1.5。本實(shí)驗(yàn)采用多波長(zhǎng)梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益資生丸中5個(gè)成分的量，對(duì)控制該品種的質(zhì)量有一定的意義。

實(shí)驗(yàn)中樣品的提取比較了不同提取溶劑 （甲醇、75%甲醇、50%甲醇）以及不同提取方法（回流提取、超聲提取）對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示以甲醇超聲提取30 min，操作簡(jiǎn)便快捷且能夠有效提取所測(cè)5個(gè)組分。

白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功效，可用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等疾病的治療。茯苓具有利水滲濕、健脾、寧心之功效，可用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥狀的治療。白術(shù)和茯苓是方中的主要藥物，同時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為白術(shù)的主要成分，去氫土莫酸、豬苓酸C和茯苓酸為茯苓的主要成分。根據(jù)所測(cè)樣品平均值的80%，暫定本品含白術(shù)以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)，每丸不得低于0.26 mg；以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ計(jì)，每丸不得低于0.15 mg。含茯苓以去氫土莫酸計(jì)，每丸不得低于0.40 mg；以豬苓酸C計(jì)，每丸不得低于0.14 mg；以茯苓酸計(jì)，每丸不得低于0.20 mg。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) （中藥成方制劑）：第七冊(cè)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：84.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：95-96，224，附錄30，附錄36.

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［4］李 偉，文紅梅，張愛(ài)華，等.白術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究-HPLC法測(cè)定2種白術(shù)內(nèi)酯的含量［J］.藥物分析雜志，2001，21（3）：170-172.

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［8］張 婷，龔志成，唐芬芬.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定參苓白術(shù)顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（12）：1619-1621.

［9］吳 慧，趙文龍，單國(guó)順，等.HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定白術(shù)及其不同麩制品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ［J］.中成藥，2013，35（11）：2484-2487.

［10］楊彥華，周遠(yuǎn)征，趙文龍，等.白術(shù)軟化切制工藝研究［J］.中成藥，2013，35（10）：2225-2229.

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Simultaneous determ ination of atractylenolide III，atractylenolide I，dehydrotum ulosic acid，polyporenic acid C and pachym ic acid in Buyi Zisheng Pills by HPLC

WANG Jian1，2， XU Jing1，2， LIPeng1，2， ZHU Jun1，2*

（1.Departmentof Pharmacy，Dongfeng Hospital Affiliated to HubeiMedical University，Shiyan 442008，China；2.Instituteof Pharmaceutical Analysis and Drug Screening，HubeiMedical University，Shiyan 442008，China）

AIMTo deve1op an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of atracty1eno1ideⅢ，atracty1eno1ideⅠ，dehydrotumu1osic acid，po1yporenic acid C and pachymic acid in Buyi Zisheng Pi11s.M ETHODSThe ana1ysis of Buyi Zisheng Pi11smethano1ic extract was performed on Hypersi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5μm）.Themobi1e phase A consisted of acetonitri1e，and themobi1e phase B consisted of0.05% phosphoric acid so1ution，their f1ow ratewas1.2 mL/min.The detection wave1ength was set at220 nm for atracty-1eno1ideⅢand atracty1eno1ideⅠ，at 241 nm for dehydrotumu1osic acid and po1yporenic acid C，at 210 nm for pachymic acid.RESULTSThe ca1ibration curves of atracty1eno1ideⅢ，atracty1eno1ide I，dehydrotumu1osic acid，po1yporenic acid C and pachymic acid were 1inear in the ranges of 4.12-82.40μg/mL（r=0.999 8），6.55-131.00μg/mL（r=0.999 4），4.30-86.00μg/mL（r=0.999 9），5.35-107.00μg/mL（r= 0.999 2）and 4.40-88.00μg/mL（r=0.999 7），respective1y，and the average recoveries（n=6）were99.0%（RSD=1.2%），97.6%（RSD=1.6%），99.1%（RSD=1.2%），97.0%（RSD=0.91%），and 97.9%（RSD=1.5%），respective1y.CONCLUSIONThe individua1 provisiona1 standard for Buyi Zisheng Pi11s is fixed at 1east no 1ess than 0.26 mg atracty1eno1ideⅢ，0.15 mg atracty1eno1ide I，0.40 mg dehydrotumu-1osic acid，0.14 mg po1yporenic acid C and 0.20 mg pachymic acid.

Buyi Zisheng Pi11s；atracty1eno1ideⅢ；atracty1eno1ideⅠ；dehydrotumu1osic acid；po1yporenic acid C；pachymic acid

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1718-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.018

2014-09-04

湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心基金 （2011年）；湖北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)基金項(xiàng)目 （2013Z-B04）；十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目 （14Y59）；2015年湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2015CFB615）；2015年度湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目 （B2015468）；湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心2013年立項(xiàng)項(xiàng)目 （GC2015206）

王 堅(jiān)（1975—），女，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。Te1：（0719）8272355，E-mai1：wanjian1unwen@163.com

*通信作者：朱 軍 （1970—），男，碩士，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)及臨床藥學(xué)工作。Te1：（0719）8272348，E-mai1：zhujun-1unwen@163.com