長(zhǎng)春胺大鼠在體腸吸收特性

相 琳， 曾 佳， 黃 婷*， 魏 莉

（1.大連大學(xué)，遼寧大連，116622；2.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海生殖健康藥具工程技術(shù)研究中心，上海200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

長(zhǎng)春胺大鼠在體腸吸收特性

相 琳1， 曾 佳2， 黃 婷2*， 魏 莉3

（1.大連大學(xué)，遼寧大連，116622；2.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海生殖健康藥具工程技術(shù)研究中心，上海200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

目的研究長(zhǎng)春胺在大鼠腸道的吸收特性。方法以酚紅為標(biāo)示物，酒石酸調(diào)節(jié)大鼠在體腸灌流液pH至4.5，采用HPLC-UV測(cè)定長(zhǎng)春胺在大鼠各腸段的質(zhì)量濃度變化。結(jié)果長(zhǎng)春胺在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中2.5 h內(nèi)累積吸收百分率 （P a）分別為 （54.66±2.37）%、（54.21±2.48）%、（53.04±4.83）%、（53.78±4.86）%，吸收速率常數(shù) （Ka）依次為 （0.248±0.020）/h、（0.183±0.058）/h、（0.231±0.046）/h、（0.200±0.069）/h。P a與Ka在各腸段均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明無(wú)特殊吸收部位。結(jié)論加入酒石酸調(diào)節(jié)長(zhǎng)春胺pH可促進(jìn)其腸黏膜通透性，從而提高其口服生物利用度。

長(zhǎng)春胺；pH依賴性；酒石酸；在體腸吸收；HPLC-UV

長(zhǎng)春胺（vincamine）是從夾竹桃科植物小蔓長(zhǎng)春花（Vinca minor L.）中提取的吲哚類生物堿［1］，具有良好的改善大腦血液循環(huán)功能，擴(kuò)張腦血管和毛細(xì)血管，而不影響心臟血流量和全身血循環(huán)，可用于由腦供血不足而引起的多種疾病，以及伴發(fā)的各種精神異常和衰老期行為障礙等［2］。長(zhǎng)春胺的半衰期僅為2 h［3］，如設(shè)計(jì)成普通制劑則每天需要頻繁服藥，因此臨床上大多以其口服緩控釋制劑為主，如商品名為奧勃蘭的長(zhǎng)春胺緩釋膠囊等。另一方面，長(zhǎng)春胺為典型的 pH依賴性藥物［4］，即在酸性條件下可溶，中性及堿性環(huán)境難溶，溶解度隨pH升高呈逐步下降趨勢(shì)，該特點(diǎn)將導(dǎo)致長(zhǎng)春胺口服制劑吸收差，生物利用度低。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)長(zhǎng)春胺腸道吸收研究的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用在體腸循環(huán)灌流模型法［5-10］，以酒石酸調(diào)節(jié)灌流液pH使長(zhǎng)春胺溶解于其中，考察其在大鼠不同腸段的吸收特性，為研究開發(fā)長(zhǎng)春胺口服制劑提供生物藥劑學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器有限公司）；HHS-2指針式電熱恒溫水浴鍋 （上海錦凱科學(xué)儀器有限公司）；Agi1ent8453紫外分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；Agi1ent 1200 series高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 藥物與試劑 長(zhǎng)春胺原料藥（批號(hào)CV/ VC070515，純度100.3%，西班牙考維克斯公司）；苯酚紅 （AR F20070906，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；烏拉坦 （CP T20061101，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Krebs-Ringer's試液（自制）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；酒石酸 （AT 50/80，法國(guó)羅蓋特公司）；其他試劑均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動(dòng)物 雄性Wister大鼠，20只，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（滬）2008-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 腸循環(huán)液中長(zhǎng)春胺的HPLC測(cè)定方法

2.1.1 Krebs-Ringer緩沖液與空白腸循環(huán)液的制備

稱取NaC17.8 g，KC10.35 g，CaC120.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgC120.02 g和葡萄糖1.4 g，加水溶解并稀釋至1 L，即得Krebs-Ringer緩沖液。Krebs-Ringer緩沖液按“2.3.2”項(xiàng)下方法，經(jīng)大鼠在體腸灌流后即得空白腸循環(huán)液。

2.1.2 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為0.02 mo1/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈 （70∶30），用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.3；柱溫25℃；體積流量1.0 mL/min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm；進(jìn)樣量為10μL。在上述色譜條件下，空白腸循環(huán)液對(duì)長(zhǎng)春胺的測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見圖1。

圖1 長(zhǎng)春胺腸灌流液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of vincam ine in intestinal perfusion

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取長(zhǎng)春胺原料藥約100 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入經(jīng)酒石酸調(diào)節(jié)pH至4.5的空白腸循環(huán)液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的長(zhǎng)春胺貯備液。精密量取該溶液以pH 4.5的空白腸循環(huán)液分別稀釋配成質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，以峰面積 （A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A= 13.657C-7.432（r=0.999 9），表明長(zhǎng)春胺在10～100μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 精密量取長(zhǎng)春胺貯備液分別配成10、40、80μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品溶液，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算樣品回收率分別為 （103.68±0.99）%、（99.22±0.77）%、（99.89±0.46）%，符合測(cè)定要求。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取10、40、80μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度樣品溶液，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，分別在一天內(nèi)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，及每天測(cè)定1次共測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品日內(nèi)精密度的RSD分別為0.28%、0.56%、0.11%；日間精密度的RSD分別為1.29%、0.95%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 配制質(zhì)量濃度為40μg/mL的樣品溶液共5份，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果RSD為1.37%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取10、40、80μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品溶液，于37℃恒溫水浴中放置2.5 h，分別于0、2.5 h取樣，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，2.5 h后樣品含量分別為 （99.32± 0.57）%、（99.25±1.85）%、（99.95±0.11）%，表明長(zhǎng)春胺在pH 4.5的空白腸循環(huán)液中2.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 腸循環(huán)液中酚紅的UV測(cè)定方法 用Krebs-Ringer緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為10、15、20、30、40、50μg/mL的系列酚紅溶液，各精密吸取酚紅溶液0.5 m L，加入0.2 mo1/L的氫氧化鈉溶液5 m L，于559 nm處測(cè)定吸光度 （A），以A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 （C）為橫坐標(biāo)，得回歸方程A= 16.482C+0.011 8（r=0.999 9），線性范圍為10～50μg/mL。取質(zhì)量濃度分別為10、20、50 μg/mL的酚紅溶液置于37℃恒溫水浴中放置2.5 h后，測(cè)定吸光度，結(jié)果酚紅濃度分別為0 h的（100.76±1.18）%、（101.88±0.61）%、（100.59± 1.02）%，表明酚紅溶液在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 大鼠在體腸吸收特性研究

2.3.1 供試液的制備 取酚紅約100 mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，以Krebs-Ringer緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL和質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL長(zhǎng)春胺貯備液4.0 mL至100 mL量瓶，用pH4.5的Krebs-Ringer緩沖液稀釋至刻度，搖勻，制得長(zhǎng)春胺質(zhì)量濃度為40μg/mL且酚紅質(zhì)量濃度為20μg/mL的供試液。

2.3.2 不同腸段的藥物吸收 取雄性Wister大鼠20只，按不同腸段分為4組，每組5只。試驗(yàn)前禁食18 h，稱定質(zhì)量后，用20%烏拉坦溶液以10 mL/kg大鼠的劑量腹腔注射麻醉，背位固定于手術(shù)板上，以紅外燈照射保持37℃體溫，沿腹中線切開腹部約3 cm。選擇所需要考察的腸段：十二指腸自幽門1 cm處開始，空腸段離幽門15 cm開始，回腸段為距離盲腸20 cm處開始，結(jié)腸段為緊鄰盲腸端至直腸，各段均取10 cm左右。在兩端剪切后插管，結(jié)扎，先用37℃生理鹽水將腸管充分洗滌后，再以空氣排出生理鹽水，用供試液以 2.0 m L/min的體積流量回流，分別于回流0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 h取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)加質(zhì)量濃度為20μg/mL的酚紅供試液5 m L。樣品經(jīng)0.45μm超濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按 “2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定長(zhǎng)春胺，同時(shí)取續(xù)濾液0.5 mL按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定酚紅。根據(jù)酚紅質(zhì)量濃度的變化矯正由于循環(huán)液體積的改變?cè)斐傻乃幬镔|(zhì)量濃度差。

長(zhǎng)春胺在大鼠各腸段的吸收百分率 （P a）與吸收速率常數(shù) （Ka）見表1，計(jì)算公式如下：P a= 1-（Cout/Cin）×（Vout/Vin）；Ka=（P a×Qin）/ V。其中，Cin和Cout分別為腸灌入液、腸流出液中藥物的質(zhì)量濃度 （μg/mL）；Vin和Vout分別為灌入和流出收集的灌流液體積 （m L）；Qin為腸道入口灌流液的體積流量（m L/min），V為灌流腸段體積（mL，V=πR2L）；L灌流腸段長(zhǎng)度 （cm）。長(zhǎng)春胺不溶于普通的Krebs-Ringer緩沖液，加入酒石酸調(diào)節(jié)pH至4.5后，長(zhǎng)春胺可溶解。溶解狀態(tài)的長(zhǎng)春胺在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收百分率均在50%以上 （見表1）；采用SPSS 9.0軟件對(duì)不同小腸吸收部位進(jìn)行方差分析可知 （見表2和表3），P a與Ka均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明溶解狀態(tài)下，長(zhǎng)春胺在腸道內(nèi)吸收較好，且無(wú)特殊吸收部位，提示在長(zhǎng)春胺口服制劑設(shè)計(jì)過(guò)程中，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)闹苿┦侄稳缂尤雙H調(diào)節(jié)劑來(lái)促進(jìn)藥物溶解，以提高其口服生物利用度。

表1 長(zhǎng)春胺在不同腸段中的吸收百分率和吸收速率常數(shù)Tab.1 Percent absorption and absorption rate constant of vincam ine in different intestinal segments

表2 長(zhǎng)春胺在不同腸段的吸收百分率方差分析Tab.2 Percent absorption variance analysis of vincam ine in differen t intestinal segmen ts

表3 長(zhǎng)春胺在不同腸段的吸收速率常數(shù)方差分析Tab.3 Absorption rate constant variance analysis of vincam ine in different intestinal segments

3 討論

藥物在胃腸道吸收特性的研究是制劑處方前研究的重要部分，根據(jù)藥物的吸收特征設(shè)計(jì)合理劑型，可以延長(zhǎng)藥物在吸收部位的滯留時(shí)間，從而提高其口服生物利用度。小腸是藥物消化吸收的主要部位，研究藥物在腸道部位的吸收特征對(duì)于指導(dǎo)制劑的處方設(shè)計(jì)，尤其是緩控釋制劑具有十分重要的意義。目前，研究藥物腸道吸收的試驗(yàn)方法可分為體外試驗(yàn)法、在體試驗(yàn)法和體內(nèi)試驗(yàn)法。其中，在體腸灌流法保證了試驗(yàn)時(shí)各種體液的供應(yīng)，可保持腸道環(huán)境較完整的生理特征，以提高試驗(yàn)的生物活性，在體吸收特點(diǎn)與人體吸收的相關(guān)性也已有試驗(yàn)證實(shí)，因此本研究采用大鼠在體腸灌流法對(duì)長(zhǎng)春胺在腸道的吸收特性進(jìn)行了初步研究。

口服固體制劑在體內(nèi)需經(jīng)崩解、分散、溶出的過(guò)程，才能被生物膜吸收，其吸收速度主要受藥物的溶出與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的限制。當(dāng)藥物溶解或溶出速率足夠快時(shí)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是藥物吸收的限速過(guò)程；但當(dāng)藥物的溶解或溶出速率較慢時(shí)，溶解或溶出則成為藥物吸收的限速過(guò)程。藥物進(jìn)入人體后需經(jīng)過(guò)食道、胃以及整個(gè)腸段，在此期間藥物的外環(huán)境pH變化較大 （各腸段的 pH分別為：十二指腸4.0～5.0、空腸5.0～6.0、回腸6.0～8.0、結(jié)腸7.0～8.0），如果藥物溶解受環(huán)境pH影響，則其溶出會(huì)不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致藥物無(wú)法透過(guò)腸道生物膜而被人體吸收。前期平衡溶解度試驗(yàn)表明，長(zhǎng)春胺在0.1mo1/LHC1中溶解度為29.64 mg/mL，在pH 1.5 PBS中溶解度為10.31 mg/mL，在蒸餾水中溶解度為0.017 3 mg/m L，在pH6.8 PBS和pH 7.8 PBS中溶解度分別為0.042 mg/mL和0.009 6 mg/mL，以上結(jié)果提示長(zhǎng)春胺為pH依賴性藥物，隨pH升高其溶解度呈下降趨勢(shì)，這意味著環(huán)境因素對(duì)藥物的釋放、溶解存在很大制約。腸吸收預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，不調(diào)節(jié)溶液pH根本無(wú)法檢測(cè)到腸循環(huán)液中的長(zhǎng)春胺，因此推斷這是由于長(zhǎng)春胺在堿性環(huán)境下不溶的緣故（Krebs-Ringer緩沖液的pH約為7.4，長(zhǎng)春胺無(wú)法溶解于該pH環(huán)境），這為其大鼠在體腸吸收特性的研究帶來(lái)一定困難。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，長(zhǎng)春胺具有腸黏膜通透性，只要突破溶解這一限速環(huán)節(jié)，其在腸道內(nèi)則具有較好的吸收能力 （溶解狀態(tài)下的長(zhǎng)春胺在整個(gè)腸段的吸收均在50%以上），提示在其制劑設(shè)計(jì)過(guò)程中，應(yīng)考慮采取適當(dāng)?shù)拇胧┤缂尤刖剖嵴{(diào)節(jié)處方微環(huán)境pH［11-14］等方法來(lái)增加藥物溶解度，從而促進(jìn)其口服制劑的體內(nèi)吸收。

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Characteristics of intestinal vincam ine absorption in rats in vivo

XIANG Lin1， ZENG Jia2， HUANG Ting2*， WEILi3

（1.Dalian University，Dalian 116622，China；2.Shanghai Instituteof Planned Parenthood Research，Key Laboratory of Contraceptives and Devices Research，Shanghai Engineer and Technology Research Center of Reproductive Health Drug and Devices，Shanghai200032，China；3.ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate the intestina1absorption of vincamine in rats for the design of vincamine ora1 formu1ations.METHODSWith pheno1 red as the indicator，and tartaric acid as the pH-va1ue（pH 4.5）adjustor for the perfusion so1ution，in vivo intestina1 perfusion mode1was thus formed.And HPLC-UV was app1ied to measuring the vincamine concentrations in different intestina1segments.RESULTSPercent absorption（P a）of vincamine within 2.5 h in duodenum，jejunum，i1eum and co1on were（54.66±2.37）%，（54.21±2.48）%，（53.04±4.83）%，（53.78±4.86）%，with the absorption rate constants（Ka）being（0.248±0.020）/h，（0.183±0.058）/h，（0.231±0.046）/h，（0.200±0.069）/h，respective1y.No significant difference either in P a or Kawas indicative of specia1absorption sites.CONCLUSIONT artaric acid use can spike the intestina1vincamine permeabi1ity，and improve the ora1bioavai1abi1ity of the formu1ations.

vincamine；pH-dependent；tartaric acid；in vivo intestina1absorption；HPLC-UV

R966

A

1001-1528（2015）08-1695-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.013

2014-10-18

相 琳（1983—），女，碩士，講師，從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。Te1：（0411）82829759，E-mai1：1ynnxiang@126.com

黃 婷 （1983—），女，碩士，助理研究員，從事藥物新技術(shù)、新劑型研究。Te1：（021）64034614，E-mai1：ting-1emon@ 163.com