γ－環(huán)糊精流動相添加劑法分離測定木瓜中的齊墩果酸和熊果酸

姚利平，楊躍清（.山西省晉中市太谷縣小白鄉(xiāng)衛(wèi)生院，晉中 030802；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 30093；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院肝病科，西安 70003）

γ－環(huán)糊精流動相添加劑法分離測定木瓜中的齊墩果酸和熊果酸

姚利平1，楊躍清2，3＊（1.山西省晉中市太谷縣小白鄉(xiāng)衛(wèi)生院，晉中 030802；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院肝病科，西安 710003）

目的 建立木瓜中齊墩果酸和熊果酸的反相高效液相分析方法，為木瓜的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 色譜柱為Kromasil C18ODS（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈－2mmol·L－1γ－CD水溶液（含1mL·L－1磷酸）（60∶40）；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為210nm。結(jié)果 齊墩果酸和熊果酸的分離良好，分離度為3.10；齊墩果酸在0.6～3.0μg（r＝0.999 9）、熊果酸在1.2～6.0μg（r＝0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均回收率分別為99.4%（RSD＝2.0%）和99.1%（RSD＝2.2%）。結(jié)論 該方法簡便、準確可靠，可作為木瓜的質(zhì)量控制方法。

γ－環(huán)糊精；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法；木瓜

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實，藥食兼用，以藥用為主。藥用木瓜最早載于《爾雅》，謂之懋木瓜，為傳統(tǒng)中藥?！吨袊幍洹?010年版一部記載其味酸，性溫，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸腫疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫［1］?，F(xiàn)代研究表明，木瓜的化學成分主要有五環(huán)三萜及其苷類、有機酸、黃酮、甾醇、原花青素、單寧和木脂素類等［2－3］。

木瓜的質(zhì)量控制主要是測定其五環(huán)三萜及其苷類的含量，如齊墩果酸和熊果酸。測定齊墩果酸和熊果酸的方法有：薄層色譜法［4］、氣相色譜法［5］、液相色譜法［6－8］和毛細管色譜法［9］。齊墩果酸和熊果酸為同分異構(gòu)體，普通薄層層析不易將二者分離，因此薄層色譜法測定的齊墩果酸實際上是熊果酸和齊墩果酸的總和。熊果酸和齊墩果酸的熔點比較高，需衍生化（甲酯化）后才能采用氣相色譜法測定，方法較為繁瑣。目前，測定齊墩果酸和熊果酸的方法最常用的方法為液相色譜法，但是，采用液相色譜法測定二者含量時，齊墩果酸和熊果酸的分離效果也較差，因此提高二者分離效果是液相色譜法測定二者含量的關(guān)鍵。

本文采用γ－環(huán)糊精作為流動相添加劑，以C18柱為固定相，對齊墩果酸和熊果酸進行了分離，效果良好；并建立了木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量的測定方法，為木瓜的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC－10Avp泵，SPD－10Avp檢測器，LC solution色譜工作站（日本島津公司）；AB135－S電子分析天平（梅特勒托利多公司）。

1.2 試藥 對照品：齊墩果酸（批號0709－9804，供含量測定用），熊果酸（批號110742－200510，供含量測定用），均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；γ－環(huán)糊精為分析純（西安敬業(yè)生物醫(yī)藥科技有限公司）；水為三蒸水；其他試劑均為分析純（西安化學試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18ODS（150 mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈－2mmol·L－1γ－CD水溶液（含1mL·L－1磷酸）（60∶40）；流速1.0 mL·min－1；柱溫為30℃；檢測波長210nm；進樣體積為10μL。

2.2 對照品溶液 取熊果酸和齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1mL含熊果酸300μg、齊墩果酸150μg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液 取木瓜藥材60℃干燥24h，粉碎并過60目篩，精密稱取藥材粉末約1.0g，置于索氏提取器中，加乙醚（200mL）提取8h，40℃水浴揮干乙醚，剩余殘渣用乙醇溶解，定容于25mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性 取熊果酸和齊墩果酸的混合對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣10 μL，記錄色圖譜。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置出現(xiàn)相同的色譜峰，齊墩果酸和熊果酸的分離度大于3.0，理論板數(shù)按熊果酸和齊墩果酸峰計算均不低于3 000，見圖1。

圖1 HPLC圖a.混合對照品溶液；b.木瓜藥材；1.齊墩果酸；2.熊果酸Fig.1 HPLC chromatogramsa.mixture reference substance solution；b.Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai；1.oleanolic acid；2.ursolic acid

2.5 線性考察 精密量取熊果酸和齊墩果酸混合對照品溶液4，8，10，12，16和20μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件檢測，記錄色譜圖。以進樣量（ng）為橫坐標（C），以色譜峰面積為縱坐標（A），繪制標準曲線。結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸分別在0.6～3.0和1.2～6.0μg范圍內(nèi)線性良好，二者的標準曲線分別為A＝81.88C－65.22（r＝0.999 9）和A＝88.31C＋162.0（r＝0.999 9）。

2.6 精密度實驗 按2.1項下色譜條件，取熊果酸和齊墩果酸混合對照品溶液重復進樣6次，測定熊果酸和齊墩果酸的精密度。結(jié)果表明，熊果酸和齊墩果酸二者峰面積的RSD（%）均小于2.0%，說明本方法精密度良好。

2.7 重復性實驗 取同一批木瓜藥材6份，照2.3項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析。結(jié)果表明，熊果酸和齊墩果酸二者含量的RSD%均小于2.0%，說明本方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性實驗 精密量取熊果酸和齊墩果酸的混合對照品溶液10μL，分別于0，2，4，6和8h進樣分析，計算齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD。結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD小于1.5%，說明熊果酸和齊墩果酸均在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率實驗 精密稱取木瓜藥材（齊墩果酸含量為4.54mg·g－1，熊果酸含量為6.32mg·g－1）0.5g，加入一定量的齊墩果酸和熊果酸對照品，按供試品溶液制備方法制備成供試溶液，按2.1項下色譜條件進行分析測定，并計算加樣回收率。結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為99.4%（RSD＝2.0%）和99.1%（RSD＝2.2%），說明該方法回收率良好。

2.10 樣品的測定 取市售木瓜藥材3批，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，采用外標法計算木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量。結(jié)果表明，3批木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的平均含量分別為4.54±0.30和6.32± 0.24mg·g－1。

3 討論

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是指淀粉用嗜堿性芽孢桿菌經(jīng)培養(yǎng)得到的環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶作用后形成的產(chǎn)物，是由6～12個D－葡萄糖分子以1，4－糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖化合物。環(huán)糊精分子中的葡萄糖單元在2位、3位有仲羥基，它們排列在圓筒形空腔的大口端；6位有伯羥基，它們位于空腔的小口端。因此，腔內(nèi)具有疏水性，而腔外具有親水性。作為流動性添加劑，環(huán)糊精空腔部分的疏水性可以與藥物分子的疏水性部分發(fā)生包合作用，而藥物分子中的極性基團則可以與環(huán)糊精分子空腔邊緣的羥基發(fā)生氫鍵等極性相互作用，因此，可以用來分離同分異構(gòu)體和手性藥物等。常用的環(huán)糊精添加劑有β－環(huán)糊精、γ－環(huán)糊精、二甲基－β－環(huán)糊精、乙酰基－β－環(huán)糊精和磺化－β－環(huán)糊精等。本實驗考察了β－環(huán)糊精、γ－環(huán)糊精、二甲基－β－環(huán)糊精對齊墩果酸和熊果酸的分離效果，結(jié)果表明，γ－環(huán)糊精作為流動相添加劑分離效果最好。

在提取溶劑上，考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯和乙醚，結(jié)果表明，乙醚作為提取溶劑時，樣品溶液中雜質(zhì)較少，對齊墩果酸、熊果酸的測定無干擾，基線較平，同時齊墩果酸、熊果酸提取效率也較高，因此，采用乙醚作為提取溶劑。在提取方法上，采用了浸漬、回流、超聲和索氏提取4種方法，結(jié)果表明，索氏提取的提取效率最高，因而，采用索氏提取的提取方式。

《中國藥典》2010年版一部木瓜藥材質(zhì)量標準含量測定項下要求齊墩果酸與熊果酸的總含量不得少于0.50%，本實驗3批木瓜藥材中齊墩果酸和熊果酸的平均含量分別為4.54和6.32mg·g－1，高于《中國藥典》要求。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典2010年版［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：57.

［2］ 敖志輝，陳建真.中藥木瓜的化學成分和質(zhì)量控制研究進展［J］.海峽藥學，2008，20（12）：79－81.

［3］ 高慧媛，吳立軍，黑柳正典.光皮木瓜的化學成分［J］.中國天然藥物，2003，1（2）：82－84.

［4］ 劉亞蓉.薄層掃描法測定藏藥晶珠肝泰舒膠囊中齊墩果酸的含量［J］.西北藥學雜志，2003，18（3）：104－105.

［5］ 周靜，劉垣升.氣相色譜法測定女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.中國新藥與臨床雜志，2003，22（10）：596－598.

［6］ 王嫦鶴，張秉華，劉芳，等.HPLC法同時測定山楂中的山楂酸、齊墩果酸和熊果酸［J］.西北藥學雜志，2011，26（1）：35－37.

［7］ 王雨梅，杜瑞芳，劉衛(wèi)東，等.HPLC法同時測定毛建草中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.西北藥學雜志，2008，23（2）：84－85.

［8］ 馮瑜娟，張藝.HPLC－ELSD法測定藏藥翼首草中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.成都中醫(yī)藥大學學報，2007，30（3）：54－56.

［9］ 王瑞，王淑美，梁生旺，等.膠束電動毛細管色譜法分離分析山茱萸中齊墩果酸和熊果酸［J］.中藥材，2007，30（8）：946－950.

Separation and determination of oleanolic acid and ursolic acid in Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai usingγ－cyclodextrin as the mobile phase modifier

YAO Liping1，YANG Yueqing2，3＊（1.White Township Hospital of Taigu County of Jinzhong in Shanxi Province，Jinzhong 030802，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Department of Hepatopathy，Chinese Medicine Hospital of Shaanxi Province，Xi′an 710003，China）

Objective To establish a reversed－phase high performance liquid chromatography method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai，and provide a basis for the quality control of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.Methods The analytical column was KromasilC18ODS（150mm×4.6mm，5μm）and the mobile phase was acetonitrile－2mmol·L－1γ－CD containing 1mL·L－1phosphoric acid（60∶40）.The flow rate was 1.0mL·min－1.The detection wavelength was 210nm.Results A baseline separation of oleanolic acid and ursolic acid was obtained，and the resolution factor was 3.10.The linearity of the method was excellent（r＝0.999 9）over the studied range of 0.6－3.0μg for oleanolic acid，and 1.2－6.0μg for ursolic acid.The recoveries were 99.4%for oleanolic acid（RSD＝2.0%）and 99.1%for ursolic acid（RSD＝2.2%）.Conclusion The method was proved to be simple，accurate and precise，and can be applied for the quality control of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.

γ－cyclodextrin；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC；Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.007

R282

A

1004－2407（2015）02－0128－04

2014－07－29）

姚利平，女，藥師

＊通信作者：楊躍清，男，主治醫(yī)師