冠心舒通膠囊對(duì)急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響

姜麗紅，吳成哲

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，長(zhǎng)春130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究生，長(zhǎng)春130117)

冠心舒通膠囊系蒙古民間驗(yàn)方［1］，臨床用于治療心血瘀阻型冠心病所引起的胸痛、胸悶、心慌、氣短等癥，臨床研究證實(shí)其具有較好的抗心絞痛作用，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其具有抗心肌缺血、抗缺氧、降脂等作用。本文通過(guò)觀察冠心舒通膠囊對(duì)心肌梗死后大鼠缺血心肌組織VEGF、PDGF表達(dá)的影響，探討冠心舒通膠囊對(duì)急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管生成的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，批號(hào):SCXK(吉)-2013-0001)，75只，體質(zhì)量(200±30)g，實(shí)驗(yàn)前正常喂養(yǎng)1周。

1.2 儀器 RSP-1002型動(dòng)物呼吸機(jī)(江西特立麻醉呼吸設(shè)備公司)、心電示波儀(Sigma美國(guó)公司)、電子天平、恒溫水浴鍋(北京六一科技公司)、微量加樣器(芬蘭GILSON公司)、組織研磨器(德國(guó)蔡司公司)、低溫高速離心機(jī)電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad美國(guó)公司)、PCR儀、熒光定量PCR儀、紫外分光光度計(jì)(Sigma美國(guó)公司)。

1.3 藥物與試劑 冠心舒通膠囊(步長(zhǎng)制藥集團(tuán)，批號(hào):140507)、注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號(hào):D0801320)、生理鹽水(吉林仙鶴草藥業(yè)有限公司)、肝素鈉注射液引物(中國(guó)江蘇常州生化千紅制藥有限公司)、通用RT-PCR試劑盒(北京索來(lái)寶科技有限公司)，CD34免疫組化抗體、VEGF免疫組化抗體、PDGF免疫組化抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠心肌梗死模型建立 健康Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg右下腹麻醉后備皮，碘酒常規(guī)消毒，背位固定，經(jīng)切開(kāi)喉管進(jìn)行氣管插管術(shù)，連接呼吸機(jī)，以75次/min、潮氣量0.7～0.8 mL行人工呼吸。在大鼠左胸口周?chē)p合成布袋口袋，在左胸第3與第4肋骨用剪刀橫切胸口，鑷子鈍性分離，于切口處打開(kāi)胸腔，兩手向下擠壓、彈壓胸腔，使心臟充分暴露在胸腔外部，剪開(kāi)心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處的微下1～2 mm處用無(wú)創(chuàng)性縫線(5/0號(hào)線)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，等心臟搏動(dòng)稍減弱，電腦顯示Ⅱ?qū)?lián)心電圖開(kāi)始變化，心電圖ST段出現(xiàn)明顯上抬，最后抬高到弓背向上為造模成功。然后在創(chuàng)口周?chē)鷩姙⑸僭S青霉素粉劑，縫合胸壁。假手術(shù)組開(kāi)胸后只過(guò)線不結(jié)扎。術(shù)后給予每只大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素150萬(wàn)u/(kg·d)，注射5 d，以預(yù)防感染，并在30℃條件下等大鼠自然蘇醒［2］。

2.2 給藥與分組 Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，冠心舒通膠囊高、低劑量組(A、B)，陽(yáng)性藥物對(duì)照組(貝復(fù)濟(jì)與肝素對(duì)照組C)，模型對(duì)照組(D)及假手術(shù)組(E)。每組15只，中藥組A、B 2組在心梗造模成功后，按高、低劑量給予大鼠灌胃1次/d。大鼠灌胃劑量∶低劑量組為成人每千克體質(zhì)量的5倍，每只大鼠灌0.2 g/kg生藥/d;高劑量組為成人每千克體質(zhì)量劑量的10倍，每只大鼠灌0.4 g/kg生藥/d，共4周;C組開(kāi)胸結(jié)扎冠脈后馬上在結(jié)扎處周?chē)柝悘?fù)濟(jì)(bFGF)噴灑，術(shù)后始皮下注射肝素120 iU/(kg·d)，共6 d;D組于術(shù)后第2天開(kāi)始每天用生理鹽水2 mL/(kg·d)灌胃1次，共4周;E組不進(jìn)行任何藥物干預(yù)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周。連續(xù)給藥4周后處死大鼠，取梗死邊緣區(qū)心肌組織，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。

2.3 CD34免疫組織化學(xué)染色 免疫組化采用SP法，DAB顯色，其中CD34抗體濃度1∶200。染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞成黃、棕色。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn):按參照文獻(xiàn)［3］以CD34的表達(dá)來(lái)標(biāo)記血管內(nèi)皮，凡是染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，凡管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層的血管區(qū)域的血管均不計(jì)數(shù)。以生物醫(yī)學(xué)圖像分析計(jì)數(shù)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)(MVC)，測(cè)定其陽(yáng)性染色面積(MVD)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別測(cè)定其MVC、MVD，取平均值作為本只大鼠的MVC、MVD 值。

2.4 心梗大鼠梗死邊緣區(qū)VEGF、PDGF-B蛋白的表達(dá) 按免疫組化法說(shuō)明操作切片，將VEGF、PDGF-B抗體染色后的心肌組織切片采用圖像分析軟件采集數(shù)據(jù)，每組5張切片，每張切片隨機(jī)選擇2個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 冠心舒通膠囊對(duì)CD34陽(yáng)性微血管數(shù)(MVC)及微血管面積(MVD)的影響 見(jiàn)表1。

表1 冠心舒通膠囊對(duì)CD34陽(yáng)性表達(dá)及血管密度的影響(±s，n=15)

表1 冠心舒通膠囊對(duì)CD34陽(yáng)性表達(dá)及血管密度的影響(±s，n=15)

注:與模型組比較:#P ＜0.05，與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05，與低劑量組比較，▲△P＜0.05

MVC MVD假手術(shù)組 8.41 ±1.21 0.006 1 ±0.001 2組 別模型組 11.30 ±1.21△ 0.021 0 ±0.002 1陽(yáng)性對(duì)照組 16.67 ±1.31#△▲ 0.040 5 ±0.003 1#△▲冠心舒通低劑量組 13.89±1.62#△ 0.027 2±0.002 8#△冠心舒通高劑量組 17.51 ±1.01#△▲ 0.041 5 ±0.002 9#△▲

3.2 對(duì)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)VEGP、PDGF-B蛋白表達(dá)量的影響 見(jiàn)表2。

表2 對(duì)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)VEGF、PDGF-B蛋白表達(dá)量的影響(±s，n=15)μm2

表2 對(duì)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)VEGF、PDGF-B蛋白表達(dá)量的影響(±s，n=15)μm2

注:與模型組比較，#P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與低劑量組比較，▲P ＜0.05

蛋白組 別 VEGF蛋白 PDGF-B假手術(shù)組 17 628.08 ±2 256.00 10 368.08 ±3 451.50模型組 20 089.07 ±3 854.65△ 17 931.07 ±2 691.91△陽(yáng)性對(duì)照組 32 079.32 ±2 549.21#△▲25 132.84 ±3 189.11#△▲冠心舒通低劑量組 27 456.28 ±2 046.91#△ 20 942.91 ±2 099.19#△冠心舒通高劑量組 32 312.31 ±2 218.45#△▲26 789.61 ±2 568.23#△▲

3.3 CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 1)CD34因子表達(dá)量各組與B組相比明顯增多，與A組對(duì)比，C組、E組增多明顯;2)PDGF蛋白表達(dá)量與B組相比明顯增多，與A組對(duì)比，C組、E組表達(dá)量增多明顯，D組增多不明顯;3)VEGF蛋白表達(dá)量與A組對(duì)比，C組、E組表達(dá)量增多明顯。

4 小結(jié)

VEGF是目前為止世界上公認(rèn)的最重要的促血管生成及生長(zhǎng)因子，又稱(chēng)血管通透性因子，具有改變細(xì)胞外基質(zhì)，增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生的生物學(xué)功能。VEGF選擇性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的特性，有特異的靶向性，和其他促血管生成因子比較，具有專(zhuān)一性。VEGF分泌的主要因素是缺血導(dǎo)致局部組織缺氧，VEGF是特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂物，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞為特異性靶細(xì)胞，具有較強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管新生的作用［4］。Wojakowski等［5］研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者體內(nèi)血漿VEGF因子表達(dá)量明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者。血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂劑，存在于血小板及上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞?；蚣易逯邪≒DGFA、B、C、D，其中PDGF-B與血管新生作用最為密切。PDGF-B蛋白不僅可以直接促毛細(xì)血管增生，且能通過(guò)誘導(dǎo)VEGFmRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速局部血液循環(huán)的重建［6］。PDGF受體當(dāng)中含有N-乙酸氨基葡萄糖和半乳糖殘基，這些都具有蛋白酶的性質(zhì)。PDGF亞基與細(xì)胞膜內(nèi)的相應(yīng)受體相互結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng):促進(jìn)細(xì)胞增殖、進(jìn)行組織修復(fù)及血管新生等［7］。

CD34是一種比較特異的血管內(nèi)皮標(biāo)記物，已被廣泛應(yīng)用。因此本試驗(yàn)采取CD34免疫組織化學(xué)染色統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性微血管數(shù)(MVC)及微血管面積(MVD)。研究［8-10］證實(shí)骨髓干細(xì)胞在特定環(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而修復(fù)損傷壞死心肌，形成新生血管，改善心功能。本實(shí)驗(yàn)證明，冠心舒通膠囊可以促進(jìn)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)CD34的蛋白表達(dá)，高低劑量組對(duì)VEGF、PDGF蛋白表達(dá)量有增生作用，效果優(yōu)于低劑量組，但與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明高劑量對(duì)血管新生作用有明顯的促進(jìn)作用。

［1］孫志堅(jiān).冠心舒通膠囊治療冠心病心絞痛臨床療效觀察［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008(4):422-424.

［2］姜麗紅，陳立紅.益氣活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌梗死大鼠心肌梗死面積及VEGF、bFGF、Ⅷ表達(dá)量的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6(12):1067-1070.

［3］TATSUTA M，IISHI H，BABA M，et al.Attenuation by genistein of sodium chloride enhanced gastric carcinogenesis induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine in Wistar rats［J］.International journal of cancer，1999，80(3):396-399.

［4］張冬梅，吳愛(ài)明，婁利霞，等.活血益氣方對(duì)心梗后大鼠缺血心肌血管新生及VEGF表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，16(8):1602-1604.

［5］WOJAKOWSKI W，MASLANKIEWICZ K，OCHALA A，et al.The pro-and anti-inflammatory markers in patients with acute myocardial infarction and chronic stable angina［J］.International Journal of Molecular Medicine，2004，14(2):317-322.

［6］BOULETREAU P J，WARREN S M，SPECTOR J A，et al.Factors in the fracture microenvironment induce primary osteoblast angiogenic cytokine production［J］.Plastic and Reconstructive Surgery，2002，110(1):139-148.

［7］謝愛(ài)國(guó)，梁紅偉，譚謙.血小板衍化生長(zhǎng)因子在細(xì)胞增殖和組織修復(fù)中的作用及機(jī)制［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(2):351-355.

［8］ZHU CHENG，BAO GANG，WANG NING.Cell mechanics:mechanical response，cell adhesion，and molecular deformation［J］.Annual review of biomedical engineering，2000，2(1):189-226.

［9］翁建宇，杜欣，張建軍，等.G-CSF對(duì)供者外周血CD34A+細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響［J］.中國(guó)輸血雜志，2007，20(2):105-107.

［10］王樹(shù)東，丁麗娟，耿嘉男，等.銀丹心腦通軟膠囊對(duì)鼠急性心肌梗死后心肌組織中骨橋蛋白表達(dá)的影響及其心肌保護(hù)作用機(jī)制［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，40(3):565-568.