金櫻子總黃酮抗氧化及清除自由基的作用研究

蘇上貴 ，韋玉蘭，黃燕軍 ，黃勇奇 ，羅廣秀

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

植物黃酮類化合物具有降血糖、降血脂、抗心律失常、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤等作用，近年來對(duì)植物黃酮的研究越來越受到關(guān)注。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，金櫻子水醇萃取液在體內(nèi)具有抗脂質(zhì)氧化作用，并能調(diào)節(jié)TGF-β等相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療IgA腎病的功效［1-2］?？傸S酮是金櫻子的主要活性成分，盡管近年來金櫻子的藥用價(jià)值和食用價(jià)值正逐步得到開發(fā)，但有關(guān)金櫻子總黃酮的藥效及作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本文在已有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)金櫻子總黃酮進(jìn)行了提取，并初步觀察了其抗氧化作用，結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 金櫻子，采集于湘桂交界處紅土生長的成熟果實(shí)，自然曬干，粉粹，40目過篩。

1.2 儀器 722型可見分光光度計(jì)（上海第三方分析儀器廠制造）；菲恰爾系列離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司制造）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 試劑 無水乙醇（分析純）、苯酚（分析純）、濃硫酸（分析純）、乙醚（分析純）、FeSO4（分析純）、3%H2O2（分析純）、0.15 mmol/L pH8.2的三羥甲基胺基甲烷（Tris）-HCl緩沖液、260 mmol/L鄰苯三酚（分析純）、濃鹽酸（分析純）、DPPH（分析純）、0.2 mmol/L pH6.6磷酸鹽緩沖液、1%鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、0.1%三氯化鐵溶液等。

2 方 法

2.1 金櫻子總黃酮的提取 取成熟金櫻子果實(shí)曬干，粉碎，過40目篩制成粉末。按1∶10的比例加入乙醚浸泡6 h脫脂，去乙醚，揮干，按質(zhì)量體積比1∶10加入60%的乙醇60℃浸泡3 h，抽濾，取濾液，50~60℃減壓蒸餾成糊狀，冷凍干燥?？傸S酮粉末用60%的乙醇溶解，4℃冷藏，備用。以蘆丁為對(duì)照品，測定總黃酮含量。

2.2 金櫻子總黃酮對(duì)·OH的清除作用 參照文獻(xiàn)［3］方法并加以改進(jìn)。取6支試管，依次編號(hào)為1~6號(hào)。分別加入5 mg/ml的金櫻子總黃酮 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，然后依次加入8 mmol/L FeSO40.5 ml，8 mmol/L 水楊酸 0.5 ml，加水 1 ml，以60%的乙醇補(bǔ)齊體積至3 ml，最后加入3%的H2O21 ml。搖勻，37℃水浴30 min，流水冷卻至室溫。用H2O作為空白調(diào)0（A0），于510nm處分別測定各管吸光度As。對(duì)照試驗(yàn)：用1.0ml蒸餾水取代H2O2溶液，其他步驟如上操作，測吸光度Ac，則樣品對(duì)·OH 的清除率為：·OH 清除率（%）=［A0-（As-Ac）］/A0×100%。

2.3 金櫻子總黃酮對(duì)O2-·的清除作用 參照文獻(xiàn)［3］，取6支試管，分別編號(hào)為1~6號(hào)，分別加入1 mg/ml的金櫻子總黃酮0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，然后加入 pH8.0 的 Tris-HCl 3.0 ml，用60%的乙醇定容至4 ml，37℃預(yù)熱5 min，加預(yù)熱好的鄰苯三酚0.5 ml，37℃反應(yīng)10 min，加濃鹽酸0.5 ml終止反應(yīng)，用H2O作為空白調(diào)0，于320 nm處測定各管吸光度As。對(duì)照試驗(yàn)：用0.5 ml蒸餾水取代鄰苯三酚溶液，其他步驟如上操作，測吸光度 Ac，則樣品對(duì)O2-·的清除率為：O2-·清除率（%）=［A0-（As-Ac）］/A0×100%。

2.4 金櫻子總黃酮總還原能力的測定 分別于6個(gè)試管中加入不同體積1 mg/ml的金櫻子總黃酮溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，并用水補(bǔ)齊至1 ml，然后加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）2.5 ml和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 ml，混合，50℃水浴保溫20 min，加入2.5 ml 10%（w/v）三氯乙酸，混勻后3 500 r/min離心5 min，精密吸取上清液2.5 ml，加入2.5 ml蒸餾水和0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液，以蒸餾水為空白，在700 nm處測定各管吸光度。吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)。

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間差異采用 t檢驗(yàn)，P ＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 金櫻子總黃酮含量 以蘆丁為對(duì)照品，采用NaOH-Al（NO2）3比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。得到金櫻子總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=10.318X+0.0054。X為蘆丁的濃度，Y為510 nm處的吸光度值。根據(jù)樣品吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品金櫻子總黃酮的含量為27.48%。

圖1 蘆丁對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 金櫻子總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用 見表1。

表1 不同濃度金櫻子總黃酮對(duì)·OH的清除作用 （±s）

表1 不同濃度金櫻子總黃酮對(duì)·OH的清除作用 （±s）

金櫻子總黃酮（mg/ml） 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 A510 1.509±0.000 1.413±0.000 1.419±0.000 1.337±0.000 1.139±0.000清除率（%） 7.84 23.69 30.67 47.31 69.73

從表1可看出，金櫻子總黃酮對(duì)·OH自由基有較強(qiáng)的清除作用，并隨濃度的增加而明顯增加，當(dāng)濃度達(dá)1.25 mg/ml時(shí)，金櫻子總黃酮對(duì)·OH的清除率達(dá)69.73%。

3.3 金櫻子總黃酮對(duì)O2-·的清除作用 見表2。

表2 不同濃度金櫻子總黃酮對(duì)O2-·的清除作用 （±s）

表2 不同濃度金櫻子總黃酮對(duì)O2-·的清除作用 （±s）

金櫻子總黃酮（mg/ml） 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 A320 2.416±0.028 2.388±0.012 2.408±0.021 2.335±0.013 2.297±0.016清除率（%） 38.87 45.38 50.39 60.07 67.09

鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生產(chǎn)中間產(chǎn)物和超氧陰離子，其產(chǎn)物在320 nm處有特征吸收。表2顯示，反應(yīng)體系中加入金櫻子總黃酮，O2-·可被迅速清除，并隨著金櫻子總黃酮濃度的升高，在去除色素背景的影響下，吸光度值降低，說明其對(duì)O2-·的清除作用增加。在濃度僅為0.04 mg/ml時(shí)，金櫻子總黃酮對(duì)O2-·的清除率可達(dá)38.87%；當(dāng)濃度為0.12 mg/ml時(shí)清除率達(dá)50.39%。

3.4 金櫻子總黃酮的總還原能力 見表3。

表3 金櫻子總黃酮的總還原能力 （±s）

表3 金櫻子總黃酮的總還原能力 （±s）

金櫻子黃酮（mg/ml） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 A700 0.576±0.011 0.856±0.036 1.186±0.034 1.462±0.035 1.625±0.053

吸光度值的高低代表總還原能力的大小。由表3可以看出，隨著金櫻子總黃酮濃度的升高，其還原能力增加，兩者呈正相關(guān)性。

4 討 論

羥基自由基和超氧陰離子自由基的化學(xué)性質(zhì)特別活潑，也是毒性最大的自由基，是造成組織脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)解聚與聚合、核酸斷裂、多糖解聚的重要活性氧，羥基自由基清除率是反映其抗氧化作用的重要指標(biāo)。據(jù)閔運(yùn)江等［4］研究結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，金櫻子黃酮類化合物用量越大，其抗氧化性越強(qiáng)，本研究結(jié)果顯示，無論是對(duì)羥基自由基還是超氧自由基的清除作用，以及總的還原能力，結(jié)果都與相關(guān)的研究結(jié)果一致。但對(duì)不同的自由基，金櫻子總黃酮的敏感性不盡相同。從上述結(jié)果看，金櫻子總黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用比較敏感，對(duì)羥自由基的清除作用相對(duì)弱一些。

本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，金櫻子水-醇萃取液在體內(nèi)具有抗脂質(zhì)氧化作用［2］。結(jié)合本研究結(jié)果，我們推測金櫻子總黃酮可能是金櫻子在體內(nèi)抗氧化作用的重要成分。

［1］曾日海，黃艷明，韋玉蘭，等.金櫻子對(duì)大鼠肝組織脂質(zhì)抗氧化作用的體外實(shí)驗(yàn)［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24（6）：68-70.

［2］韋玉蘭，黃艷明，王坤，等.金櫻子對(duì)IgA腎病大鼠腎臟組織 TGF- β 基因表達(dá)的影響［J］.陜西中醫(yī)，2007，28（11）：1566-1568.

［3］王志旺，張揚(yáng)，程芳，等.五脈綠絨蒿總黃酮及其中苜蓿素的體外抗氧化活性［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31（22）：4381-4383.

［4］閔運(yùn)江，劉文中，陳乃富.皖西大別山區(qū)金櫻子野生資源儲(chǔ)備量的調(diào)查研究［J］.生物學(xué)雜志，2001，18（2）：26-28.