坎地沙坦干預(yù)大鼠動脈粥樣硬化血管形態(tài)的作用

周玉娟，劉莉，劉春穎，曹曉華，陳濤平

（1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

坎地沙坦干預(yù)大鼠動脈粥樣硬化血管形態(tài)的作用

周玉娟1，劉莉1，劉春穎1，曹曉華2，陳濤平2

（1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

目的探討坎地沙坦對動脈粥樣硬化大鼠血管形態(tài)的影響。方法通過給正常大鼠飼喂高脂飼料，建立動脈粥樣硬化模型。將50只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，坎地沙坦低、中、高劑量組。12周后取相同部位主動脈分別進(jìn)行固定、染色，在光鏡及電鏡下進(jìn)行觀察，并測量血管內(nèi)膜、中膜厚度。結(jié)果模型組與正常組相比主動脈出現(xiàn)動脈粥樣硬化的形態(tài)學(xué)改變；與模型組相比坎地沙坦低、中、高劑量組動脈粥樣硬化的形態(tài)學(xué)改變有所減輕。模型組與正常組相比，內(nèi)膜與中膜厚度顯著增加（P＜0.01)；與模型組相比，坎地沙坦中、高劑量組可明顯減輕動脈內(nèi)膜及中膜厚度（P＜0.01)。結(jié)論坎地沙坦可減輕大鼠動脈粥樣硬化形態(tài)學(xué)改變，減少血管內(nèi)膜、中膜的增生。

坎地沙坦；動脈粥樣硬化；形態(tài)學(xué)

本文引用：周玉娟,劉莉,劉春穎,等.坎地沙坦干預(yù)大鼠動脈粥樣硬化血管形態(tài)的作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2015,32(3): 6-10,39.

坎地沙坦是選擇性血管緊張素Ⅱ受體Ⅰ型（angio-tensinⅡtype1 receptor,AT1）拮抗劑，屬于聯(lián)苯四唑非肽類藥物，1998年7月于瑞典首次上市?？驳厣程棺饔糜贏T1受體，因而對于心血管及靶器官有強(qiáng)大作用?？驳厣程古R床主要應(yīng)用于高血壓、心力衰竭，作用于冠心病病理生理的多個環(huán)節(jié)，是一個具有廣泛臨床應(yīng)用前景的藥物[1]。采用給大鼠高脂飲食并腹腔注射維生素D3的方法建立動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）模型，觀察坎地沙坦對AS大鼠血管形態(tài)的影響。

1 材料

1.1 主要藥品和試劑

迪沙藥業(yè)的坎地沙坦，賽爾克生物公司的膽固醇，北京奧博星公司的豬膽酸鈉，上海朝暉藥業(yè)的丙基硫氧嘧啶，由河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究生實(shí)驗(yàn)室配制的中性甲醛。由河北大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室配制的戊二醛固定液。

1.2 主要儀器設(shè)備

KD-BM生物包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），OLYMPUSBX50光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司），H-7500透射電子顯微鏡（日本日立公司），LEICA RM2126石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.3 動物分組和處理

SPF級SD大鼠50只，自由飲食，體質(zhì)量（197.2±5.6）g，均為雄性，許可證號: SCXK(冀) 2008-1-003，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只：正常對照組，動脈粥樣硬化模型組，坎地沙坦高［10 mg/（kg·d）］、中［5 mg/（kg·d）］、低［1 mg/（kg·d）］劑量干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 動脈粥樣硬化大鼠模型的建立

于實(shí)驗(yàn)第二周正常對照組喂食正常飼料，模型組、坎地沙坦各干預(yù)組均高脂飼料喂養(yǎng)并腹腔注射維生素D3建立動脈粥樣硬化模型。（高脂飼料由基礎(chǔ)飼料配方中添加2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽酸鈉、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶配制），正常對照組腹腔注射相同體積生理鹽水。坎地沙坦各干預(yù)組分別按照高、中、低藥物劑量進(jìn)行灌胃，對照組、模型組均給予等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃，共12周。

2.2 取材

于造模12周末，大鼠空腹12 h后，進(jìn)行如下操作：（1）腹腔注射苯巴比妥進(jìn)行麻醉。（2）大鼠仰臥位固定，去毛、消毒皮膚。沿正中線剪開、固定。（3）分離血管（主動脈弓至骼總動脈分叉處），剔除脂肪及結(jié)締組織。（4）取主動脈弓，4 ℃生理鹽水沖洗干凈，在相同部位切取動脈環(huán)4個，放入4%戊二醛溶液進(jìn)行前固定，冰箱4 ℃保存，待檢。（5）主動脈弓下緣取主動脈1～2 cm， 10%中性甲醛固定，室溫保存，待檢。

2.3 檢測項(xiàng)目及方法

固定好的腹主動脈，按步驟進(jìn)行脫水、石蠟包埋，切片，HE染色、光學(xué)顯微鏡觀察。用Imagepro plus6.0軟件，每組選8張切片，測定血管內(nèi)膜、中膜的厚度。電鏡固定標(biāo)本經(jīng)0.1 M PBS清洗、1%餓酸固定、乙醇梯度逐級脫水、丙酮與樹脂混合液浸透后放入盛有環(huán)氧樹脂812、815混合包埋液的包埋板中置于烤箱中37 ℃、45 ℃、60 ℃各24 h。切片后，用檸檬酸鉛和醋酸鈾進(jìn)行雙重電子染色，設(shè)定80 kV的加速電壓，透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 光鏡觀察結(jié)果

正常組：血管壁各層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，層次清楚光滑；內(nèi)膜無增生，厚薄均勻；中膜彈力纖維同心圓狀排列，平滑肌細(xì)胞呈梭形，無增生，排列整齊；外膜為疏松結(jié)締組織，見圖1。

模型組：血管壁內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)可見，但不清晰。內(nèi)皮細(xì)胞階段性損傷脫落，內(nèi)皮下層寬度增加；內(nèi)膜厚度增加明顯，內(nèi)膜下聚集大量泡沫細(xì)胞，見圖2箭頭所示；內(nèi)彈力板斷裂，凸起部位可見大量鈣鹽沉積，見圖3箭頭所示；有平滑肌細(xì)胞的遷移，且雜亂無章，向管腔突出；外膜無明顯改變。

圖1 正常組血管HE染色(×400)

圖2 模型組血管HE染色(×600)

圖3 模型組血管HE染色(×400)

坎地沙坦低劑量組：內(nèi)皮細(xì)胞階段性損傷脫落，內(nèi)皮下層寬度增加；內(nèi)膜增厚內(nèi)膜下間隙增大；平滑肌細(xì)胞排列紊亂，并增生遷移入內(nèi)膜，見圖4箭頭所示；坎地沙坦中、高劑量組：內(nèi)皮細(xì)胞較少破損；內(nèi)膜較光滑；中膜厚度正常；平滑肌細(xì)胞排列整齊，無增生遷移，見圖5、圖6。

圖4 坎地沙坦低劑量組血管HE染色(×400)

圖5 坎地沙坦中劑量組血管HE染色(×400)

圖6 坎地沙坦高劑量組血管HE染色(×400)

3.2 電鏡觀察結(jié)果

正常組主動脈管壁結(jié)構(gòu)清晰。內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、扁平，表面平滑，細(xì)胞膜完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體結(jié)構(gòu)清晰正常，無脂質(zhì)沉積，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間細(xì)胞連接緊密，內(nèi)彈力板平直，厚薄均勻、完整連續(xù)；平滑肌細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，大小均勻，無內(nèi)膜下遷移，見圖7。

模型組內(nèi)皮細(xì)胞壞死、溶解，大面積與基底膜脫離或脫落，內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜破損、缺失、不連續(xù)；細(xì)胞核碎裂溶解線粒體嵴溶解、斷裂、消失；內(nèi)彈性膜密度不均，薄厚不均，見圖8；有些內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見較大圓形脂滴，見圖9。平滑肌細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)模糊；線粒體嵴溶解、斷裂、消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象。

圖7 正常組血管電鏡表現(xiàn)（×4.0k）

圖8 模型組血管電鏡表現(xiàn)（×4.0k）

圖9 模型組血管電鏡表現(xiàn)（×12.0k）

坎地沙坦低劑量組內(nèi)皮細(xì)胞壞死、溶解，部分或大面積與基底膜脫離或脫落，內(nèi)彈性膜密度不均，薄厚不均；平滑肌細(xì)胞線粒體嵴溶解、斷裂、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，有脫顆粒現(xiàn)象，有顆粒融合；細(xì)胞內(nèi)有圓形脂滴存在；排列紊亂，伸出偽足，向內(nèi)皮下遷移，打亂內(nèi)彈力膜，見圖10所示。中劑量組內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡增加，可見線粒體嵴有一定損傷，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有所擴(kuò)張，內(nèi)彈性膜薄厚均勻，見圖11；平滑肌細(xì)胞排列整齊，無內(nèi)膜下遷移。高劑量組內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；內(nèi)彈性膜薄厚均勻平滑肌細(xì)胞排列整齊，無內(nèi)膜下遷移，見圖12。

圖10 坎地沙坦低劑量組血管電鏡表現(xiàn) （×9.0k）

圖11 坎地沙坦中劑量組血管電鏡表現(xiàn) （×4.0k）

圖12 坎地沙坦高劑量組血管電鏡表現(xiàn) （×8.0k）

3.3 坎地沙坦對血管內(nèi)膜、中膜厚度的影響

模型組與正常組相比，內(nèi)膜與中膜厚度顯著增加（P＜0.01）；低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；坎地沙坦中、高劑量組較模型組內(nèi)膜、中膜厚度均有顯著減少（P＜0.01），而坎地沙坦高劑量組較中劑量組內(nèi)膜增生減少明顯（P＜0.05），見表1。

表1 坎地沙坦對動脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)膜、中膜厚度的影響（±s）

表1 坎地沙坦對動脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)膜、中膜厚度的影響（±s）

與正常組相比，aP＜0.01；與模型組相比，bP＜0.01；與坎地沙坦中劑量組相比，cP＜0.05。

4 討論

目前由動脈粥樣硬化導(dǎo)致的冠心病已經(jīng)成為威脅中國人民身體健康的第一殺手。動脈粥樣硬化是一種較為復(fù)雜的、緩慢進(jìn)展的病理生理過程，會導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)改變，功能障礙[2]，其最終會形成粥樣硬化斑塊。斑塊形成會造成血管管腔狹窄，血流受到影響，造成靶器官供血不足，嚴(yán)重時斑塊破裂，血栓形成，促發(fā)心腦血管事件。

本試驗(yàn)通過透射電鏡觀察到AS模型組血管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異常改變。內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化可使血管內(nèi)膜的屏障作用減弱或者消失，同時內(nèi)皮細(xì)胞脫落、內(nèi)膜裸露可以引起血小板聚集及血栓形成[3]。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管自身的保護(hù)屏障受到破壞，打破了各種生物活性物質(zhì)之間的平衡，比如細(xì)胞生長因子。這種情況可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，引起大量細(xì)胞外基質(zhì)生成并沉積在內(nèi)膜[4]，血管舒縮功能障礙，炎性細(xì)胞粘附于內(nèi)膜促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

坎地沙坦是一種具有高度選擇性、組織親和力強(qiáng)、解離慢、強(qiáng)效、長效的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）。腎素血管緊張素Ⅱ受體可分為AT1、AT2、AT3、AT4。心血管系統(tǒng)中主要存在AT1和AT2，現(xiàn)已知AngⅡ的大部分心血管效應(yīng)由AT1介導(dǎo)。但越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5]: AT2 具有拮抗AT1的功能，AT1活性受拮抗時AT2活性增強(qiáng)。AT1受體激動時，引起血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)、外周血管組織升高、心輸出量增多等效應(yīng)。而AT2受體介導(dǎo)血管舒張，能激活緩激肽/NO/cGMP降壓途徑，與AT1受體引起的血管收縮效應(yīng)相反。并且阻斷AT2受體能增強(qiáng)AT1受體介導(dǎo)的PGE2作用，引起血管收縮[6]。AT2 受體可以發(fā)揮抗增殖、促血管平滑肌細(xì)胞分化、凋亡效應(yīng)，并且能抑制血管的生長發(fā)育[7]。研究證實(shí)在AT2受體缺乏的情況下，小鼠左側(cè)股動脈損傷后，與AT2受體正常相比，血管平滑肌的DNA合成增加、凋亡減少，并且新生內(nèi)膜的合成也增加?？驳厣程故茿T1受體拮抗藥，能減少AngⅡ，下調(diào)血管MMP-2、VEGF的表達(dá)，從而降低血管內(nèi)膜通透性及血管重構(gòu)[8]，并且能拮抗AngⅡ引起的肝臟血管收縮，增加肝臟內(nèi)血流，保護(hù)肝臟功能[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，坎地沙坦能減輕大鼠動脈粥樣硬化的形態(tài)學(xué)改變。具體機(jī)制需進(jìn)一步探索研究。

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（責(zé)任編輯：高艷華）

Candesartan on morphological change of artery in atherosclerosis rats

ZHOU Yujuan1,LIU Li1,LIU Chunying1,CAO Xiaohua2,CHEN Taoping2
(1.College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China; 2.Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Candesartan on morphological change of the artery in atherosclerosis model rats.MethodsNormal rats were fed with high lipid feedstuff to set up atherosclerosis rat model.Fifty rats were randomly divided into normal group,atherosclerosis model group,groups of low,medium and high dose of Candesartan.After 12 weeks,the arteries of the same place in rats of each group were determined and observed under light microscope and electron microscope.At the same time,we measured the intimal and medial thickness of vascular walls.ResultsCompared with normal group,morphological change of atherosclerosis in the arteries of model group had been observed.Compared with model group,morphological change of atherosclerosis which could be observed under microscope of the Candesartan group had decreased.In model group,compared with normal group,the intimal and medial thickness of vascular walls were signifcantly increased(P＜0.01).Compared with model group,the intimal and medial thickness were significantly reduced(P＜0.01).ConclusionCandesartan can infuence the morphology of artery in atherosclerosis rats and reduce the hyperplasia in the intima and media of vascular walls.

Candesartan; atherosclerosis; morphology

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.03.002

R54

A

1674-490X(2015)03-0006-05

2015-03-07

河北省教育廳項(xiàng)目（Z2011286）；保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（10ZF068）

周玉娟（1964—），女，河北深州人，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。

E-mail: zyj@hbu.edu.cn

陳濤平（1976—），男，河北邯鄲人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事臨床骨科學(xué)研究。E-mail: CTP00@163.com