表面活性蛋白A 不同亞型在脂多糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞IL-8 表達(dá)中的作用

胡鳳琪 崔 龍 明 靜 袁 海

SP-A 是一種首先發(fā)現(xiàn)在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)的凝集素，在調(diào)節(jié)肺天然免疫中發(fā)揮著重要作用，可識(shí)別和清除多種病原體，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的吞噬作用，還可通過(guò)作用于不同細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)［1］。SP -A 蛋白包括兩個(gè)亞型:SP-A1 及SP -A2，本研究組先前的研究已經(jīng)證實(shí)，SP-A 除在肺表達(dá)外，在腎臟中也有表達(dá)，主要分布于腎小管上皮細(xì)胞，且脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞SP-A1 及SP-A2 的表達(dá)升高［2］。筆者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SP -A/D 雙基因敲除小鼠在發(fā)生泌尿系感染時(shí)其白細(xì)胞介素-8(IL-8)分泌較野生型小鼠減少，但其作用機(jī)制尚不明確［3］。本研究探討SP - A 不同亞型對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞IL -8 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討SP -A及其亞型在腎臟炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用。

材料與方法

1.材料:人近曲腎小管上皮細(xì)胞株HK -2 購(gòu)自ATCC，DMEM/F12 培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。LPS O111:B4 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green 實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO 公司。人IL -8 ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD 公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，待細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。采用1μg/ml 的LPS 刺激轉(zhuǎn)染及對(duì)照組HK-2 細(xì)胞8h 后檢測(cè)SP -A1、SP -A2 及IL -8表達(dá)水平變化。

3.siRNA 轉(zhuǎn)染HK-2 細(xì)胞:轉(zhuǎn)染所用SP -A1 及SP -A2特異性siRNA 購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司(SP -A1，SI04353202;SP-A2，SI00716590)。按照3 ×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞種植于6 孔板內(nèi)，然后將含有150ng 的siRNA 或者用作陰性對(duì)照的negative siRNA(Cat. No. SI02693285)分別與15μl HiPerfect轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)轉(zhuǎn)染24h 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)SP -A1、SP -A2 表達(dá):Trizol 法提取細(xì)胞RNA，2μgRNA 行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物即為cDNA。采用25μl反應(yīng)體系行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件:(1)SP-A1:SP-A1 引物上游:5' - AAGCAGCTGGAGGCTCTGT - 3'，下游:5' -TGCTCTCACTGACTCACACCA-3'，退火溫度59.3℃。(2)SP-A2:SP-A2 引物上游:5' -GAGCCTGAAAAGAAGGAGCA-3'，下游:5' - TCCAACACAAACGTCCTTCA - 3'，退火溫度57℃。(3)β - actin:β - actin 引物上游:5' - GTCCACCGCAAATGCTTCTA -3'，下游:5' - TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。

5.ELISA 法檢測(cè)IL-8 蛋白表達(dá):取細(xì)胞上清液，離心去細(xì)胞碎片，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)各組中IL-8 蛋白濃度。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.LPS 刺激對(duì)HK -2 細(xì)胞SP -A1、SP -A2 表達(dá)的影響:實(shí)時(shí)定量PCR 示，1μg/ml LPS 作用HK -2 細(xì)胞8h 可顯著增加其SP -A1、SP -A2 mRNA 的表達(dá)(P ＜0.05)。

圖1 LPS 對(duì)HK-2 細(xì)胞SP-A1、SP-A2 表達(dá)的影響

2.轉(zhuǎn)染siRNA 后各組HK-2 細(xì)胞SP-A1、SPA2 mRNA 表達(dá):實(shí)時(shí)定量PCR 示，HK -2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SP-A1 siRNA 后，SP-A1 mRNA 表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA 組顯著降低(P ＜0.05)，SP-A2 mRNA 表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化。轉(zhuǎn)染SP -A2 siRNA 后，SP -A2 表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組顯著降低(P ＜0.05)，SP -A1 mRNA 表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA 不影響SP -A1、SP-A2 mRNA 表達(dá)水平(P ＞0.05，圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染不同siRNA 后HK-2 細(xì)胞SP-A1、SP-A2 mRNA 表達(dá)

3.HK-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNA 后對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IL-8 表達(dá)的影響:ELISA 示，1μg/ml LPS 作用8h 可顯著增加HK-2 細(xì)胞IL -8 的分泌(P ＜0.05)。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA 及SP -A1 siRNA 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IL-8 的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變(與單純LPS 刺激組相比，P 均＞0.05)，而轉(zhuǎn)染SP -A2 siRNA 則可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的IL-8 的表達(dá)(P ＜0.05，圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染不同siRNA 后對(duì)LPS 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞IL-8 表達(dá)的影響

討 論

SP-A 是選擇素蛋白家族的成員之一，最早在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，可降低肺泡表面張力，對(duì)于維持肺泡擴(kuò)張狀態(tài)有重要作用。同時(shí)，SP-A 在天然免疫中也發(fā)揮著重要作用，其在炎癥狀態(tài)下可促進(jìn)NF-κB 的活化，進(jìn)而促進(jìn)多種炎性因子的產(chǎn)生［4］。本研究組先前的研究表明，SP-A 在腎臟內(nèi)主要分布于腎小管上皮細(xì)胞，其在動(dòng)物及人類的泌尿系感染時(shí)表達(dá)均增加，且SP-A 的基因多態(tài)性與泌尿系感染的易感性有關(guān)［5，6］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SP -A/D 雙基因敲除小鼠對(duì)泌尿系感染的易感性增加，其在發(fā)生泌尿系感染時(shí)IL -8 分泌較野生型小鼠減少［3］。但其具體作用機(jī)制及SP-A 亞型在其中的作用目前尚不明確。SP-A 有兩個(gè)亞型，SP -A1 及SP -A2，關(guān)于SP-A 亞型在腎臟炎癥中所起的作用，目前研究的較少，值得進(jìn)一步研究。

既往的研究表明，SP -A1 及SP -A2 在功能上有所不同，其主要區(qū)別在于調(diào)節(jié)炎性因子分泌及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬中作用的差異，既往研究發(fā)現(xiàn)SP -A2在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞IL -8 及TNF -α 分泌中的作用較SP-A1 強(qiáng)［7］。但目前尚無(wú)分別特異性針對(duì)SP -A1及SP-A2 的抗體，其針對(duì)SP-A1 及SP-A2 的mRNA 表達(dá)水平變化就顯得尤為重要［7］。LPS 可激活腎小管上皮細(xì)胞NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)IL -8 等多種炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。IL -8 是參與機(jī)體炎癥與免疫的重要細(xì)胞因子，與腎臟感染的關(guān)系密切，其在泌尿系感染起募集中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可誘導(dǎo)SP -A1、SP -A2 及IL -8 表達(dá)上調(diào)，這與既往筆者的研究結(jié)果相符［2］。本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，采用特異性siRNA 下調(diào)SP -A2 表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞IL -8 的上調(diào)，而改變SP -A1表達(dá)則未見(jiàn)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IL-8 表達(dá)有所影響，說(shuō)明在SP-A 亞型中的SP -A2 可能在LPS 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的炎性因子表達(dá)中發(fā)揮重要作用，這可能是SP-A/D 雙基因敲除小鼠在泌尿系感染時(shí)IL -8 分泌不足的機(jī)制之一，因LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，而SP -A/D 雙基因敲除小鼠缺乏了SP-A2 在LPS 誘導(dǎo)IL -8 中的促進(jìn)調(diào)節(jié)作用，因此其在感染時(shí)IL-8 分泌不足，從而對(duì)泌尿系感染的易感性增加。

綜上所述，LPS 可誘導(dǎo)HK -2 細(xì)胞SP - A1 及SP-A2 表達(dá)增加，下調(diào)SP -A2 可部分抑制LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞IL -8 的表達(dá)，SP -A2 在腎臟炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

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