炮制對巴戟天中蒽醌類成分的影響

李 倩， 朱水娣， 劉 碩， 馬務(wù)迢， 劉偉賢， 丁 平*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣東 廣州 510006；3.無限極 （中國）有限公司，廣東廣州510665）

［飲片炮制］

炮制對巴戟天中蒽醌類成分的影響

李 倩1， 朱水娣2， 劉 碩3， 馬務(wù)迢3， 劉偉賢3， 丁 平1*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣東 廣州 510006；3.無限極 （中國）有限公司，廣東廣州510665）

目的研究巴戟天的3種炮制品 （巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天）在炮制過程中蒽醌類化學(xué)成分的變化。方法應(yīng)用HPLC檢測技術(shù)，以甲基異茜草素-1-甲醚及總蒽醌類化學(xué)成分為評價指標(biāo)，分別考察3種炮制品在不同蒸制時間、加鹽量及鹽蒸時間、甘草量及煎煮時間條件下蒽醌類化學(xué)成分的變化。結(jié)果甲基異茜草素-1-甲醚在加熱和加入輔料鹽后均有增溶現(xiàn)象，但隨著時間的延長，其含有量逐漸下降；在加入輔料甘草后該成分明顯下降?？傒祯惢瘜W(xué)成分在不同炮制過程中隨著加熱時間的增加和輔料鹽、甘草的加入，其變化均為先上升后下降。結(jié)論控制巴戟天炮制時間和輔料用量有助于控制巴戟天炮制品的質(zhì)量。

巴戟天；蒽醌；甲基異茜草素-1-甲醚；炮制

巴戟天來源于茜草科巴戟天屬植物Morinda officinalis How的干燥根，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效［1］，是著名的 “四大南藥”之一。巴戟天含有蒽醌、寡糖、多糖、環(huán)烯醚萜等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒽醌類化學(xué)成分具有抗菌、降壓、降脂、抗癌、抗骨質(zhì)疏松等作用［2］，是巴戟天的主要活性成分之一。臨床用巴戟天多以炮制品為主，主要為巴戟肉、鹽巴戟天和制巴戟天。炮制會使巴戟天中多種化學(xué)成分發(fā)生變化［3-6］，中藥炮制后化學(xué)成分及物質(zhì)基礎(chǔ)的變化是中藥炮制前后性味、功能改變的重要原因，闡明炮制過程中化學(xué)成分的變化是中藥炮制機理研究的主要內(nèi)容［7］。目前，關(guān)于多種中藥化學(xué)成分在炮制過程中變化規(guī)律的研究較多［8-10］，但對炮制過程中巴戟天蒽醌類化學(xué)成分變化的研究還不夠全面。為此，本研究結(jié)合相關(guān)炮制方法［11-14］，利用高效液相色譜技術(shù) （HPLC）對巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天在炮制過程中蒽醌類化學(xué)成分的變化進(jìn)行系統(tǒng)地研究，從而為巴戟天炮制方法的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters 2695 Separations Module高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CHROMAP1.5色譜指紋圖譜分析系統(tǒng)解決方案 （珠?？坡兴幯芯坑邢薰荆?；Sartorius BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器設(shè)備有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

巴戟天藥材來源于德慶縣高良鎮(zhèn)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)丁平研究員鑒定為巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源研究室。甲基異茜草素-1-甲醚對照品為自制品 （HPLC檢測，純度＞98%）。乙腈、甲醇（色譜純，美國Spectrum公司），磷酸 （色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），三氯甲烷為分析純，水為去離子水。

2 方法

2.1 巴戟天不同炮制品的制備 巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天參照 《中國藥典》［1］并結(jié)合表1中條件制備。各炮制品平行制備2份，粉碎，過60目篩。

表1 巴戟天各炮制品制備工藝考察Tab.1 Factors of processing of processed Morindae officinalis Radix

2.2 色譜條件 色譜柱DiamonsilTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～5 min，20%A；5～10 min，20%～44%A；10～40 min，44%A；40～50 min，44%～95%A；50～55 min，95%A）。體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測波長277 nm；柱溫30℃。

2.3 對照品溶液制備 取甲基異茜草素-1-甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 取巴戟天粉末 （過60目篩）5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入三氯甲烷100 mL，于80℃加熱回流提取2次，每次2 h。濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜。以甲基異茜草素-1-甲醚為參照峰，所得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，同時用相似度評價軟件計算，各指紋圖譜相似度達(dá)0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批藥材粉末6份，按照 “2.4”項方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定指紋圖譜，所得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，各指紋圖譜相似度達(dá)0.95以上，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別在0、2.5、5、10、24、48 h進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜，所得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，各指紋圖譜相似度達(dá)0.99以上，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀測定，記錄55 min的色譜圖，計算各共有峰的峰面積。

2.7 巴戟天蒽醌類化學(xué)成分指紋圖譜共有模式的建立 收集10批巴戟天規(guī)范化種植基地的樣品，以 “2.4”項供試品溶液制備方法處理，按照“2.2”項色譜條件測定，將得到的HPLC圖使用“指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) （chromap 1.5）”軟件分析，選取參照圖譜，利用中位數(shù)法進(jìn)行多點校正自動匹配后生成巴戟天蒽醌類化學(xué)成分指紋圖譜共有模式 （圖1），并構(gòu)建巴戟天蒽醌類化學(xué)成分HPLC指紋圖譜 （圖2）。與對照品對比表明，12號峰為甲基異茜草素-1-甲醚 （S），計算各指紋峰的相對保留時間，以峰出現(xiàn)率100%計，共標(biāo)定23個共有峰 （其峰面積總和計為總蒽醌）。10批樣品相似度在0.97～0.99之間。

圖1 巴戟天蒽醌類化學(xué)成分HPLC指紋圖譜共有模式Fig.1 HPLC fingerprint common pattern of anthraquinones from Morindae officinalis Radix

圖2 10批巴戟天蒽醌類化學(xué)成分HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprin ts of anthraquinones from 10 batches of Morindae officinalis Radix

3 結(jié)果

3.1 巴戟肉在炮制過程中蒽醌類化學(xué)成分的變化規(guī)律 巴戟肉在不同時間 （20～240 min）蒸制時，隨蒸制時間的增加，甲基異茜草素-1-甲醚在20 min升至最高，然后緩慢下降，90 min后低于生巴戟天；總蒽醌類化學(xué)成分在60 min時達(dá)到最高，然后逐漸下降 （圖3）。由于巴戟天在蒸制60 min時較易去心，符合 《中國藥典》［1］蒸法的要求，因此，炮制巴戟肉時，蒸制時間以60 min為宜。

3.2 鹽巴戟天在炮制過程中蒽醌類化學(xué)成分的變化規(guī)律 考察不同加鹽量 （1%～8%）對鹽巴戟天中蒽醌類化學(xué)成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲基異茜草素-1-甲醚及總蒽醌類化學(xué)成分隨加鹽量的增加均呈先上升后下降的趨勢，在3%時最高 （圖4），故以3%作為鹽巴戟天最佳加鹽量。

圖3 巴戟肉在不同蒸制時間條件下蒽醌類化學(xué)成分峰面積變化曲線Fig.3 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix steamed at differen t tim e

以3%加鹽量炮制鹽巴戟天時，考察其在不同時間 （20～240 min）鹽蒸時蒽醌的變化規(guī)律，結(jié)果顯示：隨鹽蒸時間的增加，甲基異茜草素-1-甲醚在20 min升至最高，然后緩慢下降，60 min后低于生巴戟天；總蒽醌類化學(xué)成分在60 min時達(dá)到最高，然后逐漸下降 （圖5）。因此，以3% 加鹽量炮制鹽巴戟天時，鹽蒸時間以60 min為宜。

圖4 鹽巴戟天在不同鹽濃度條件時蒽醌類化學(xué)成分峰面積變化曲線Fig.4 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix at the condition of different salt concentrations

圖5 3%鹽巴戟天在不同鹽蒸時間條件下蒽醌類化學(xué)成分峰面積變化曲線Fig.5 Curves of anthraquinones'peak area of 3% Morindae officinalis Radix salted at d ifferent time

3.3 制巴戟天在炮制過程中蒽醌類化學(xué)成分的變化規(guī)律 根據(jù) 《中國藥典》［1］和文獻(xiàn)［15］記載，考察甘草用量4%～10%對制巴戟天中蒽醌類化學(xué)成分的影響，實驗結(jié)果表明：甘草制巴戟天HPLC指紋圖譜在10.70 min（X1）、14.40 min（X2）、20.52 min（X3）、47.48 min（X4）、48.38 min（X5）、50.13 min（X6）處出現(xiàn)新的色譜峰 （圖6中箭頭所示），其中X2色譜峰面積最大，且隨甘草用量增加而明顯遞增，經(jīng)與甘草生藥材HPLC指紋圖譜對比發(fā)現(xiàn)，X1、X2、X4、X5、X6與甘草中的化學(xué)成分一致，說明以上成分為制巴戟天在炮制過程中引入甘草而產(chǎn)生的，而X3有待進(jìn)一步探討。在此過程中，甲基異茜草素-1-甲醚明顯下降；總蒽醌類化學(xué)成分呈上升趨勢，在甘草用量為8%時達(dá)到最高，然后近于平穩(wěn) （圖7）。綜合以上因素，以8%作為制巴戟天中甘草的最佳用量。

以甘草用量8%炮制制巴戟天時，考察其在不同時間 （20～120 min）煎煮時蒽醌的變化規(guī)律，結(jié)果表明：隨煎煮時間的增加，甲基異茜草素-1-甲醚逐漸下降，總蒽醌類化學(xué)成分在30 min時達(dá)到最高，然后逐漸下降 （圖8）。因此，以甘草用量8%炮制巴戟天時，煎煮時間以30 min為宜。

圖6 制巴戟天與生巴戟天蒽醌類化學(xué)成分HPLC指紋圖譜對比Fig.6 Difference of HPLC chrom atogram s between raw and licorice-processed Morindae officinalis Radix

3.4 巴戟天炮制方法制定 根據(jù)上述變化規(guī)律，制定巴戟天各炮制品的炮制方法，即：巴戟肉以生巴戟天加水悶潤3.5 h至透心，文火蒸60 min；鹽巴戟天為每100 g生巴戟天加入3% 的食鹽水50 m L，悶潤3.5 h，文火蒸60 min；制巴戟天為每100 g生巴戟天加入8%的甘草汁250 mL，悶潤30 min，文火煎煮30min至甘草汁被吸盡。炮制后均趁熱除去木心，干燥。

圖7 制巴戟天在加不同甘草量時蒽醌類化學(xué)成分峰面積變化曲線Fig.7 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix at add ing different licorice

圖8 8%甘草制巴戟天在不同煎煮時間條件下蒽醌類化學(xué)成分峰面積變化曲線Fig.8 Curves of anthraquinones'peak area of 8%Morindae officinalis Radix decocted at different tim e

3.5 驗證試驗 以 “3.4”方法炮制巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天各3批進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果表明，甲基異茜草素-1-甲醚的變化規(guī)律為鹽巴戟天＞巴戟肉＞生巴戟天＞制巴戟天，總蒽醌的變化規(guī)律為鹽巴戟天＞制巴戟天＞巴戟肉＞生巴戟天（圖9），與上述研究結(jié)果一致。

圖9 巴戟天各炮制品中蒽醌類化學(xué)成分的比較Fig.9 Com parison of anthraquinones from processed Morindae officinalis Radix

4 討論

4.1 巴戟天在應(yīng)用不同方法炮制的過程中，甲基異茜草素-1-甲醚在加熱和加入輔料鹽后，都出現(xiàn)增溶現(xiàn)象使其含有量升高，這與中藥在炮制中加熱及加入輔料可增溶、助溶或起協(xié)同作用而增效的目的一致［16］，但隨著時間的延長，其含有量逐漸下降，可能為蒽醌在長時間濕熱條件下不穩(wěn)定、發(fā)生降解所引起［17］。因此，科學(xué)合理地優(yōu)化最佳炮制時間尤其重要。而在制巴戟天的炮制過程中，由于甘草的加入，甲基異茜草素-1-甲醚明顯下降，與文獻(xiàn)［18］報道甘草與大黃共煎時大黃素甲醚含有量下降的結(jié)果相似，是否是與甘草中三萜皂苷或其他成分發(fā)生作用，有待進(jìn)一步深入研究。

4.2 巴戟天中總蒽醌類化學(xué)成分在不同炮制過程中隨加熱時間的延長、輔料鹽和甘草的加入，變化規(guī)律為先上升后下降，說明適當(dāng)?shù)募訜?、輔料鹽、甘草［19］對總蒽醌類化學(xué)成分均有助溶作用，而長時間的加熱則可能使蒽醌類成分發(fā)生降解。

經(jīng)本研究優(yōu)化的方法炮制后，巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天中總蒽醌含有量均高于生巴戟天，與文獻(xiàn)［6，20］報道結(jié)果一致。

4.3 甘草制巴戟天中出現(xiàn)了6個新色譜峰，其中5個與甘草中的成分一致，另外1個未知，該未知成分的產(chǎn)生是否為甘草中的三萜皂苷、黃酮類成分對蒽醌的作用，仍需進(jìn)一步探討。

4.4 目前以蒽醌類成分評價巴戟天炮制品質(zhì)量的研究多為各炮制品HPLC指紋圖譜或成分含有量的比較［21-22］，而現(xiàn)有炮制方法并未指明炮制時間或明確的炮制終點，造成巴戟天炮制品質(zhì)量存在差異。本研究考察了炮制過程中炮制時間和輔料對巴戟天蒽醌類化學(xué)成分的影響，揭示了該類成分在炮制過程中的變化，提出了各炮制品詳細(xì)的炮制方法，為有效控制巴戟天炮制品的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：75-76.

［2］曹 亮，周建軍.蒽醌類化合物的研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24（3）：237-238.

［3］景海漪，史 輯，崔 妮，等.巴戟天炮制前后寡糖類成分HPLC-CAD指紋圖譜研究［J］.中草藥，2014，45（10）：1412-1417.

［4］徐吉銀，梁英嬌，丁 平.炮制方法對巴戟天有效成分水晶蘭苷含量的影響［J］.中藥材，2007，30（1）：20-22.

［5］肖鳳霞，鄧超明，劉玉健，等.巴戟天炮制前后微量元素的含量變化研究［J］.中藥材，2011，34（1）：37-39.

［6］鐘 成，許曉峰.炮制方法對巴戟天蒽醌類成分指紋的影響研究［J］.中藥材，2012，35（7）：1049-1053.

［7］蔡寶昌，秦昆明，吳 皓，等.中藥炮制過程化學(xué)機理研究［J］.化學(xué)進(jìn)展，2012，24（4）：637-649.

［8］金曉勇，賈曉斌，孫 娥，等.炙淫羊藿炮制過程中5種黃酮類成分變化規(guī)律研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（21）：2738-2742.

［9］李 麗，肖永慶.大黃飲片炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（4）：803-813.

［10］周 潔，郭蘭萍，黃璐琦，等.基于道地藥材標(biāo)準(zhǔn)的炮制蒼術(shù)揮發(fā)油變化規(guī)律研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44（8）：567-570.

［11］劉 碩，馬方勵，李養(yǎng)學(xué)，等.巴戟天及不同鹽分炮制品中糖類成分HPLC-ELSD指紋圖譜研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：106-110.

［12］胡昌江，周弋芠，李金連，等.鹽制巴戟天工藝研究［J］.中成藥，2009，31（12）：1890-1893.

［13］杜曉盼，李景麗，李秀芹.綜合評分法優(yōu)選沙苑子鹽蒸工藝研究［J］.中醫(yī)學(xué)報，2012，27（6）：720-721.

［14］張文娟，房敏峰，李云峰，等.正交試驗法優(yōu)選甘草制遠(yuǎn)志炮制工藝［J］.中成藥，2008，30（2）：232-235.

［15］馬青青，陳華國，趙 超，等.正交試驗法優(yōu)選制吳茱萸的炮制工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：35-38.

［16］王正益，龔千峰.中藥炮制學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001：21.

［17］蘇子仁，周 華，劉中秋，等.大黃在提取精制工藝中的化學(xué)成分變化研究（Ⅰ）大黃素的濕熱降解機理探討［J］.藥物分析雜志，1998，18（2）：83-86.

［18］秦 云，李 祥，陳建偉，等.大黃中蒽醌類成分配伍前后的量變規(guī)律［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（5）：94-98.

［19］曾靈娜，王伽伯，張 萍，等.中藥調(diào)劑規(guī)范化研究（Ⅲ）：含不同類型成分的中藥對大黃蒽醌煎出量的影響［J］.中國中藥雜志，2012，37（2）：202-206.

［20］陳美燕，郭素華，高 佳，等.炮制方法對南靖巴戟天蒽醌含量的影響［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2009，25（12）：840-841.

［21］崔 妮，史 輯，賈天柱.巴戟天不同炮制品HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2014，45（13）：1871-1875.

［22］姜永糧，楊 丹，張 凡.巴戟天炮制前后蒽醌類成分含量變化［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：64-66，69.

Changes of anthraquinones from processed Morindae officinalis Radix

LIQian1， ZHU Shui-di2， LIU Shuo3， MA Wu-tiao3， LIUWei-xian3， DING Ping1
（1.College of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Clinic of Guangzhou University of ChineseMedicine，Guangzhou 510006，China；3.Infinitus（China）Company Limited，Guangzhou 510665，China）

AIMTo investigate the changes of anthraquinones from three kinds of processed Bajitian（Morindae officinalis Radix），including steaming-，salt-steaming-，and licorice-boiling Bajitian.METHODSRubiadin-1-methyl ether and total anthraquinones contentwere selected as quality index by HPLC to analyze the changes under the conditions of the steaming time，the salt consumption，salt-steaming time，the licorice consumption and decoction time.RESULTSThe solubilization for rubiadin-1-methyl ether was found in the heating process and the addition of salt，but their contentgradually decreased as the heating time extended.Butadding licorice reduced rubiadin-1-methyl ether content.With the heating time extended and the addition of excipients，the peak area of total anthraquinones increased and then decreased.CONCLUSIONControlling the processing time plays a key role in the control of processed products of Bajitian.

Bajitian（Morindae officinalis Radix）；anthraquinone；rubiadin-1-methyl ether；processing

R283

：A

：1001-1528（2015）06-1284-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.027

2014-10-08

巴戟天鹽炙品指紋圖譜 （蒽醌）研究 （PPD/11/07/014）；廣東省自然科學(xué)基金重點項目 （06105061）

李 倩 （1990—），女，碩士生，研究方向為中藥資源有效成分與質(zhì)量評價。Tel：15521302860，E-mail：liqian0080@ 126.com

*通信作者：丁 平 （1965—），女，博士，研究員，研究方向為中藥資源有效成分與質(zhì)量評價。Tel：（020）39358080，E-mail：dingpinggz@126.com