響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑木耳多糖的硫酸化工藝研究

李婷婷， 王振宇， 尹紅力， 劉 冉， 張乃珣

(1.東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑木耳多糖的硫酸化工藝研究

李婷婷1， 王振宇2*， 尹紅力1， 劉 冉1， 張乃珣1

(1.東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

[目的] 優(yōu)化黑木耳多糖的硫酸化工藝。[方法]用硫酸法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行硫酸化修飾，用響應(yīng)面法研究了修飾條件中反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)試劑配比(正丁醇∶濃硫酸)(C)3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)物的硫酸基取代度的影響，并建立回歸模型，驗(yàn)證其有效性。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，在反應(yīng)溫度為-20～28 ℃、反應(yīng)時(shí)間為0.5～2.5 h、反應(yīng)試劑配比(正丁醇∶濃硫酸)為1∶2～1∶4范圍內(nèi)，3個(gè)因素與產(chǎn)物平均取代度(Y)的回歸模型為Y=0.54-0.011A-0.008 8B- 0.017C+0.029A×B-0.044A×C+0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2；F檢驗(yàn)證明模型擬合較好，可以用于量化控制條件；3個(gè)因素對(duì)取代度的影響程度為C>A>B，并且各因素之間交互影響顯著。[結(jié)論] 對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行硫酸化修飾可提高其硫酸化程度，從而增加黑木耳多糖的生物活性。

響應(yīng)曲面；黑木耳多糖；硫酸化

硫酸化修飾是指通過(guò)化學(xué)的方法在多糖的結(jié)構(gòu)中，引入硫酸根基團(tuán)。多糖經(jīng)過(guò)硫酸化后，在分子結(jié)構(gòu)中引入了帶有負(fù)電荷的硫酸根基團(tuán)，整個(gè)分子會(huì)顯示聚陰離子特性，可以阻斷病毒與機(jī)體細(xì)胞的吸附，從而增加天然多糖的多種生物學(xué)活性[1-2]。黑木耳是藥食同源真菌，屬真菌類擔(dān)子菌綱，主要分布在我國(guó)東北地區(qū)的大、小興安嶺。黑木耳不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有多種藥理功能[3-4]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，黑木耳具有抗氧化[5-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10-11]和抗凝血[12-13]、抗菌[14]等活性，但多糖的水溶性差限制了其活性更好地發(fā)揮，而化學(xué)修飾可以提高多糖在水中的溶解度，增強(qiáng)其生物活性。

研究表明，硫酸化多糖的生物活性與硫酸化的程度有一定的關(guān)系[15]，筆者是通過(guò)用濃硫酸法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行修飾，用響應(yīng)曲面法對(duì)黑木耳多糖的硫酸化修飾進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期達(dá)到提高其硫酸化程度，從而增加黑木耳多糖的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料供試原料：黑木耳。主要試劑：氯化鋇、明膠、硫酸銨、氫氧化鈉、石油醚、無(wú)水乙醇、丙酮、正丁醇、濃硫酸、氯仿、三氯乙酸、鹽酸，均為分析純。主要儀器：臺(tái)式離心機(jī)TDL-5，上?？婆d儀器有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-205B，上海申勝儀器公司；電熱恒溫水槽DK-8D型，上海一恒科技有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)FJ-200，天津泰斯特儀器公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240，上海一恒科技有限公司；電子天平Y(jié)P200lN，上海精天電子儀器廠；漩渦混合器XW-80A，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 黑木耳多糖的提取和精制將黑木耳清洗干凈，置于烘箱中烘干，進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩，使用石油醚將過(guò)篩后的黑木耳粉脫脂。以料液比1∶90 g/ml的比例，將脫脂后的黑木耳粉分別浸于純水中，在90 ℃下攪拌提取3 h，4 000 r/min離心15 min，收取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取3次，將提取液進(jìn)行脫色處理，用3% H2O2在50 ℃溫度下，保溫脫色2 h，使用saveg法除去蛋白，然后用流動(dòng)水透析12 h，蒸餾水透析12 h，透析液用80%無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，沉淀物用丙酮、乙醚清洗除雜，將清洗后的沉淀物干燥至恒重，得到黑木耳多糖[16-17]。用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量為85.9%，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白含量為1.3%。

1.3 單因素影響試驗(yàn)主要考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)試劑比例對(duì)硫酸化黑木耳多糖取代度的影響。

1.4 多糖硫酸化修飾響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取硫酸用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素，以所制備的黑木耳硫酸酯的硫酸基取代度(DS)為響應(yīng)值，用Box-Behnken設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)，3個(gè)因素的水平值區(qū)間一般在如下范圍：溫度-20～28 ℃，反應(yīng)時(shí)間0.5～2.5 h，反應(yīng)試劑配比為1∶2～1∶4，同時(shí)考慮模型設(shè)計(jì)要求值須在中心點(diǎn)周圍對(duì)稱分布，故所取因素水平中心點(diǎn)為反應(yīng)溫度4 ℃，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，反應(yīng)試劑(正丁醇∶濃硫酸)配比1∶3，中心點(diǎn)和中心點(diǎn)兩側(cè)的水平取值代號(hào)0、1和-1表示(表1)，3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)。

表1 黑木耳多糖硫酸化響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.5 黑木耳多糖硫酸酯化操作按試驗(yàn)設(shè)定的正丁醇和濃硫酸的體積比例，置于帶干燥和攪拌裝置的反應(yīng)瓶中，再加入硫酸銨0.125 g，冰浴冷卻至0 ℃，攪拌30 min，緩慢加入多糖粉末0.5 g，放入特定的溫度下反應(yīng)相應(yīng)的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后用5 mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH 8.0，混合溶液經(jīng)透析，濃縮，冷凍干燥所得產(chǎn)物即為硫酸化黑木耳多糖[18]。

1.6 硫酸化黑木耳多糖取代度測(cè)定用氯化鋇-明膠法。取1 mol/L HCl溶解K2SO4使其濃度為1.087 5 mg/ml，分別吸取該溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.16、0.18、0.20 ml，用1 mol/L HCl補(bǔ)足至0.2 ml,分別加入三氯乙酸3.8 ml，氯化鋇-明膠溶液1.0 ml和明膠溶液1.0 ml充分混合后室溫靜置15 min，用分光光度計(jì)測(cè)定混合液360 nm處的吸光值，記錄各組氯化鋇-明膠組與明膠組吸光值之差，以硫酸根濃度為橫坐標(biāo)，差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶于1 mol/L HCl配成1 mg/ml的溶液,100 ℃水浴中水解4 h。取2份0.2 ml水解液，同法測(cè)定氯化鋇-明膠組和單一明膠組的吸光值，計(jì)算兩組之差。將測(cè)樣差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品溶液中硫酸基濃度S%，S%除以樣品濃度(1 mg/ml)得固體樣品中硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)S%[19-20]。取代度計(jì)算公式：

DS=(1.62×S%) /(32-1.02×S% )。

1.7 回歸模型的建立以17次試驗(yàn)反應(yīng)條件編碼值(A、B、C)為自變量,以產(chǎn)物的DS為響應(yīng)值(Y)，用Design-Expert軟件擬合多元回歸模型:Y=k0+k1×A+k2×B+k3×C+k4×A×B+k5×A×C+k6×B×C+k7×A2+k8×B2+k9×C2，求最佳k0～k9值，生成回歸方程。

1.8 回歸模型的參數(shù)分析對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,將總方差變異來(lái)源拆分為回歸模型、失擬指數(shù)(lack of fit value)和純誤差3項(xiàng)。如果回歸模型未達(dá)到顯著水平(P>0.5)，表示該模型不適合用來(lái)解釋和預(yù)測(cè)此試驗(yàn);如果失擬指數(shù)達(dá)到顯著水平(P<0.5)，表示各試驗(yàn)點(diǎn)實(shí)際值偏離理論值過(guò)大，擬合效果較差。

將方差分析結(jié)果中模型變異來(lái)源拆分成各因素及其交互項(xiàng)，根據(jù)F值判定其對(duì)響應(yīng)值的影響是否顯著,及影響程度大小。將3個(gè)因素中的1個(gè)因素編碼值取0，得到其他2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的方程，作相應(yīng)的三維曲面圖和等高線圖分析這種影響的變化趨勢(shì)，可得到顯著水平的交互效應(yīng)。

1.9 回歸模型的有效驗(yàn)證將A、B、C分別取值為-1、0、1,在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果用t檢驗(yàn)判定是否與理論值相符。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸化黑木耳多糖取代度的影響固定反應(yīng)溫度為0 ℃，濃硫酸與正丁醇的比例為3∶1，選擇不同的反應(yīng)時(shí)間，按硫酸化操作方法進(jìn)行對(duì)黑木耳多糖的分子修飾。如圖1所示，反應(yīng)時(shí)間在1 h時(shí)，取代度最可達(dá)0.47，時(shí)間越長(zhǎng)，取代度反而下降。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)硫酸化黑木耳多糖取代度的影響固定反應(yīng)時(shí)間為1 h，濃硫酸和正丁醇體積比3∶1，改變反應(yīng)溫度，以測(cè)定其對(duì)黑木耳多糖硫酸化反應(yīng)取代度的影響。由圖2所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為4 ℃時(shí)，取代度較高，但隨著溫度的繼續(xù)提高，酯化產(chǎn)物的取代度明顯下降。所以低溫更加利于濃硫酸酯化反應(yīng)。

2.3 反應(yīng)試劑比例對(duì)硫酸化黑木耳多糖取代度的影響固定反應(yīng)時(shí)間為1 h，反應(yīng)溫度為4 ℃，改變濃硫酸和正丁醇體積比，以考察不同反應(yīng)試劑的比例對(duì)硫酸酯化取代度的影響。由圖3可知，硫酸酯產(chǎn)物的取代度隨著濃硫酸含量的增加呈先提高后下降的趨勢(shì)，而過(guò)高的濃硫酸含量會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物取代度的下降。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)響應(yīng)值17次試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黑木耳多糖硫酸化修飾響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.5 回歸模型硫酸基平均取代度(Y)與反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)、正丁醇∶濃硫酸(C) 3個(gè)因素編碼空間的多元回歸方程：Y=0.54-0.011A-0.008 8B-0.017C+0.029A×B-0.044A×C+0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2。

2.6 回歸模型的有效性回歸模型的方差分析得出：F回歸模型=262.48,P回歸模式<0.0001；F失擬=4.42,P失擬=0.092 6。

由此可見(jiàn)，失擬指數(shù)P值為0.092 6大于0.05，表明回歸方程無(wú)失擬因素存在，回歸式擬合得較好?；貧w方程顯著檢驗(yàn)P值小于0.01，表明回歸方程達(dá)到極顯著，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以用來(lái)解釋和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

2.7 回歸模型參數(shù)分析回歸模型的參數(shù)估計(jì)值如下：F模型=262.48,P模型<0.000 1;FA=14.70,PA=0.006 4;FB=9.17,PB=0.019 2;FC=33.57,PC=0.000 7;FAB=49.35,PAB=0.000 2;FAC=114.59,PAC<0.000 1;FBC=6.24,PBC=0.041 1;FA2=822.32,PA2<0.000 1;FB2=1 129.50,PB2=0.001 2;FC2=27.22,PC2<0.000 1。

由此可見(jiàn)，模型中A、C、AB、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01，表明它們對(duì)黑木耳多糖硫酸化產(chǎn)物平均取代度有極顯著的影響，B、BC的P值均小于0.05，表明其對(duì)取代度影響顯著(P<0.05)。

同時(shí)，根據(jù)F值大小可推知，試劑比例對(duì)黑木耳多糖硫酸酯硫酸取代度的影響最大，其次是反應(yīng)時(shí)間，最后是反應(yīng)溫度，即試劑比例>反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度。

利用Design Expert 7．0 軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，得到反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、試劑比3 個(gè)因素之間的響應(yīng)面立體分析圖及相應(yīng)的等高線圖，見(jiàn)圖 4、5、6。預(yù)測(cè)最佳點(diǎn)為A=1.43，B=-1.48，C=1∶3.96，分別對(duì)應(yīng)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及實(shí)際配比，以此估計(jì)響應(yīng)值的理論值為0.539 5。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)由于實(shí)驗(yàn)室條件限制采用優(yōu)化條件反應(yīng)溫度 4 ℃、反應(yīng)時(shí)間1.4 h、 試劑配比為1∶4進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)的取代度分別為0.520 2、0.509 7、0.521 1，平均為0.517 0，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近。因此，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法得到的硫酸酯化黑木耳多糖的合成工藝可以用來(lái)指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

常用的多糖硫酸化方法有濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸-吡啶法，濃硫酸有低毒、操作方便、收率較高等優(yōu)點(diǎn)，故該試驗(yàn)采用濃硫酸法進(jìn)行修飾。該試驗(yàn)結(jié)果表明，采用濃硫酸法將黑木耳多糖進(jìn)行硫酸化修飾切實(shí)可行。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間和溫度一定，硫酸化多糖的取代度隨反應(yīng)試劑中的濃硫酸與正丁醇的比例呈先升高后減少的趨勢(shì)，原因可能是由于增加了濃硫酸的用量，使黑木耳多糖降解。所以適當(dāng)?shù)臐饬蛩崤c正丁醇的比例會(huì)使多糖充分獲得硫酸基。當(dāng)其他條件不變，隨著反應(yīng)溫度的升高，樣品的硫酸化取代度先升高后降低，原因可能是溫度升高有利于反應(yīng)的進(jìn)行，但在酸性條件下溫度過(guò)高會(huì)使靈芝多糖發(fā)生降解。因此，在單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定黑木耳多糖硫酸化最佳的條件為：濃硫酸和正丁醇的體積比為1∶4，溫度為4 ℃，反應(yīng)時(shí)間1.4 h，在此條件下，硫酸化產(chǎn)物取代度為0.517 0。

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Optimization on Sulfated Technology ofAuriculariaauricularPolysaccharides by Response Surfce Method

LI Ting-ting1, WANG Zhen-yu2*, YIN Hong-li1et al

(1.Department of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2.Department of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150090)

[Objective] To optimize concentrated sulfuric acid esterification forAuriculariaauriculapolysaccharides.[Method]Auriculariaauricalapolysaccharide was modified by concentrated sulfuric acid esterification method.The influences of reaction time (A), reaction temperature (B) and reactive reagent Ratio (n-butyl alcohol to concentrated sulfuric acid) (C) on the degree of substitution (DS) of production were studied by response surface methodology (RSM).Recursive model was established, the validity of the model was tested and the main effect and interaction of the factors were analyzed.[Result] The results indicated that within the range of A being -20-28 ℃, B being 0.5-2.5 h and C being 1∶2-1∶4, the regression model between three factors and average DS (Y) wasY=0.54-0.011A-0.008 8B-0.017C+0.029A×B-0.044A×C+0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2.TheFtest proved that the model possessed well fit and could be used to control the reaction conditions.The influencing degree of three factors on DS was C>A>B.There was extremely significant interaction between various factors.[Conclusion] Improving sulfuric acid esterification degree can strengthen bioactivity ofAuriculariaauriculapolysaccharides.

Response surface methodology;Auriculariaauriculapolysaccharides; Concentrated sulfuric acid esterification

李婷婷(1989- )，女，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向：功能性食品研究與開(kāi)發(fā)。*通訊作者，博士生導(dǎo)師，從事功能性食品研究開(kāi)發(fā)。

2015-03-09

S 509.9

A

0517-6611(2015)11-263-04