H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株的無血清培養(yǎng)

郭 琦 耿興良 龍?jiān)气P 楊 帆 宋紹輝 劉 婧 戴宗祥 姜述德 廖國陽

流感病毒是威脅人類健康的主要病原體之一。目前對于流感病毒的主要有效預(yù)防方法依然是接種流感疫苗［1］。流感減毒活疫苗能夠以與自然狀態(tài)下機(jī)體感染流感野毒株相同的機(jī)制引起機(jī)體產(chǎn)生長效的細(xì)胞免疫和體液免疫，使機(jī)體獲得交叉免疫保護(hù)的同時不會產(chǎn)生較明顯的感染癥狀［1～3］。鑒于雞胚生產(chǎn)流感病毒疫苗存在很多不足之處，WHO 推薦使用Vero 細(xì)胞作為流感疫苗的生產(chǎn)介質(zhì)［4～8］。Vero 細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒時，需要添加TPCK-胰酶裂解HA0 后病毒才能感染細(xì)胞。Vero 細(xì)胞培養(yǎng)使用的血清所含的類淀粉蛋白P，是甲型流感病毒表面唾液?；堑鞍椎囊种苿?，可通過影響TPCK 活性進(jìn)而影響病毒的產(chǎn)量，同時血清作為培養(yǎng)基組分也存在較多弊端［6，9～12］。而無血清培養(yǎng)，既可戒除血清對流感病毒產(chǎn)量的影響，又能使后期工藝純化不受血清中復(fù)雜組分的左右［10，11，13］。故本實(shí)驗(yàn)對無血清條件下培養(yǎng)H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株的適宜條件進(jìn)行了探索。

材料與方法

1.材料：無血清培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞( SFM-Vero) 第140 代，甲型流感病毒冷適應(yīng)株A/Yunnan/1/2005 Vca ( H3N2) ，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室保存。TPCK-胰酶( Worthington 公司) ； BSA( 北京鼎國生物公司) ；DMEM/F12 和RPMI-1640 培養(yǎng)基( 美國Thermo 公司) ；MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基由醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所溶液組配制；帶FITC 標(biāo)記的兔抗山羊綠色熒光抗體( BD 公司) 。BeckmanG25 離心機(jī)( Beckman 公司) ；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、血凝板( Nunc 公司) ；細(xì)胞培養(yǎng)箱( 賓德公司) ；H-7650 透射式電子顯微鏡( 日立公司) 。

2.實(shí)驗(yàn)方法：( 1) 冷適應(yīng)株H3N2 對無血清Vero 細(xì)胞的感染性檢測：使用SFM -Vero 細(xì)胞鋪至細(xì)胞爬片。培養(yǎng)24h后接種病毒，設(shè)立陰性對照孔。先后加多聚甲醛溶液、Triton-100、甲醇及BSA 溶液。加羊抗H3N2 血清及FITC 標(biāo)記兔抗羊抗體孵育后封片觀察。( 2) 無血清培養(yǎng)流感病毒冷適應(yīng)株H3N2 的條件優(yōu)化：①接種病毒胞齡的選擇：使用MTT法在波長490nm 處測定吸光度值( A) ，按照均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 求出區(qū)間，剔除不在此區(qū)間的A490值，求得平均值后，繪制細(xì)胞生長曲線，根據(jù)曲線選取不同點(diǎn)接種病毒，確定適合流感病毒冷適應(yīng)株增殖的適宜細(xì)胞胞齡［10］；②基礎(chǔ)培養(yǎng)基的的選擇：分別以DMEM/F12、1640、MEM∶ DMEM/F12(1∶1) 的混合液、MEM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒，每個條件做4 個平行，(25.0 ±0.5) ℃培養(yǎng)相同時間后收獲病毒液，測定其血凝效價［14］；③pH 值對流感病毒產(chǎn)量的影響：使用DMEM/F12 配制病毒培養(yǎng)液，調(diào)整病毒培養(yǎng)液pH 分別為6.89、7.15、7.37、7.64、7.84、7.97 培養(yǎng)H3N2 流感病毒相同時間后測定血凝效價；④BSA-TPCK 胰酶添加量對流感病毒產(chǎn)量的影響： 以組合的方式向病毒培養(yǎng)液中添加不同含量的BSA 和TPCK 胰酶，培養(yǎng)相同時間后收獲病毒并測定血凝效價；⑤病毒培養(yǎng)過程中TPCK 胰酶補(bǔ)加時間及補(bǔ)加量的優(yōu)化： 分別在病毒培養(yǎng)的24、48、72、96h 補(bǔ)加TPCK 胰酶，每次均按照0.3、0.6、1.0、1.3μg/ml 的終濃度分別進(jìn)行補(bǔ)加，培養(yǎng)相同時間后測定病毒血凝效價；⑥病毒接種量對其產(chǎn)量的影響：在之前優(yōu)化的條件下，分別按照MOI 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 的量接種流感病毒，培養(yǎng)相同時間后測定血凝效價，確定適宜接種量； ⑦病毒收獲時間的確定：按優(yōu)化出來的條件培養(yǎng)病毒，每隔12h 進(jìn)行取樣，測定病毒的血凝效價，繪制病毒大致的增殖曲線，并依此來進(jìn)一步優(yōu)化病毒的收獲時間；⑧病毒完整性檢測：使用電子顯微鏡對無血清培養(yǎng)的H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株進(jìn)行形態(tài)觀察，并與10%血清培養(yǎng)的病毒形態(tài)進(jìn)行對比。

結(jié) 果

1.病毒侵染性實(shí)驗(yàn)： 免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，被流感病毒感染的細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，陰性對照基本不顯示熒光。說明H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株可以在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞中增殖( 圖1) 。

圖1 冷適應(yīng)株H3N2 流感病毒在SFM-Vero細(xì)胞上的免疫熒光( ×100)

2.H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株培養(yǎng)條件的優(yōu)化：(1) 細(xì)胞胞齡的選擇： 依據(jù)生長曲線，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的12、24、36、48h 接種流感病毒，培養(yǎng)相同時間后測定病毒血凝效價［11］。結(jié)果顯示胞齡為36h 接種培養(yǎng)出來的病毒效價最高，為1∶256。( 表1) 。( 2) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇： 以DMEM/F12 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒時，病毒效價為1∶240 均比其他培養(yǎng)基高，確定DMEM/F12 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基( 表2) 。(3) 病毒培養(yǎng)液pH 值的確定：本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)培養(yǎng)液的pH 值呈現(xiàn)弱堿性即pH 值為7.15 ～7.64 時，培養(yǎng)出的病毒血凝效價最高為1∶240( 表3) 。( 4) BSA 和TPCK 胰酶添加量對流感病毒產(chǎn)量的影響：通過測定病毒收獲液的血凝效價后發(fā)現(xiàn)，BSA 和TPCK 胰酶添加的終濃度均在0.8 ～1.2μg/ml，可達(dá)到1∶224( 表4) 。(5) TPCK胰酶補(bǔ)加量和補(bǔ)加時間對流感病毒產(chǎn)量的影響：病毒培養(yǎng)96h 后按照1μg/ml 終濃度補(bǔ)加TPCK 胰酶，病毒效價最高為1 ∶256，測定血凝效價結(jié)果( 表5) 。(6) 接種量對病毒產(chǎn)量的影響： 培養(yǎng)條件得到初步的優(yōu)化以后，病毒的接種量也是影響病毒產(chǎn)量的一個重要因素。從培養(yǎng)結(jié)果看，流感病毒接種量在0.05 ～0.10MOI 時，病毒效價最高可達(dá)1∶256 且穩(wěn)定。( 7)病毒收獲時間的確定：繪制出病毒大致的增殖曲線如圖3。確定病毒的收獲時間為168h，血凝效價最高，為1∶256。(8) 病毒完整性檢測：如圖4 所示，無血清條件下培養(yǎng)出的流感病毒輪廓清晰，形態(tài)完整。與對照中10%血清培養(yǎng)的病毒相比，形態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 細(xì)胞生長曲線

表1 不同胞齡的SFM-Vero 細(xì)胞接種H3N2 流感病毒后的平均血凝效價

表2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對病毒效價的影響

表3 不同pH 值對病毒效價的影響

表4 TPCK 胰酶和BSA 添加量對病毒效價的影響

表5 不同時間補(bǔ)加不同量的TPCK 胰酶后的病毒效價

圖3 病毒增殖曲線

圖4 不同血清條件培養(yǎng)的H3N2 流感病毒的形態(tài)( ×15000)

討 論

流感病毒減毒活疫苗能夠引起機(jī)體持久而多樣的免疫反應(yīng)，為流感的預(yù)防提供了新思路［15］。目前主要使用流感病毒冷適應(yīng)株，溫敏株或是復(fù)制缺陷株作為減毒活疫苗備選株［16］。已上市的減毒活疫苗均是以雞胚為介質(zhì)生產(chǎn)的，而使用細(xì)胞生產(chǎn)減毒活疫苗仍在研發(fā)中。Vero 細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒時，需添加TPCK 胰酶裂解流感病毒HA0 蛋白，促進(jìn)流感病毒吸附在細(xì)胞表面，使其能夠有效增殖［11］。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中殘留的血清成分會影響TPCK 胰酶的活性，從而影響流感病毒的產(chǎn)量。無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)無疑是流感病毒減毒活疫苗制備的最佳選擇，美國百特公司亦使用該技術(shù)培養(yǎng)流感病毒。本研究對H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株的無血清培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株對無血清培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞有感染性，為此對其無血清培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。細(xì)胞培養(yǎng)36h 后接種病毒，所得病毒效價較高，此時細(xì)胞剛生長成致密的單層，且細(xì)胞活力高，對流感病毒敏感。培養(yǎng)時間短于36h，細(xì)胞對TPCK 胰酶的耐受力較低；超過36h，由于胞齡過長，細(xì)胞對病毒的敏感度下降，最終均影響病毒產(chǎn)量。同時，實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出DMEM/F12 為病毒培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。病毒培養(yǎng)液的pH 值為7.15 ～7.64時既不影響細(xì)胞狀態(tài)又不影響TPCK 胰酶活性，較適合病毒增殖。此外BSA 作為培養(yǎng)液中的重要成分可單獨(dú)或與TPCK 胰酶共同影響病毒產(chǎn)量。當(dāng)BSA 和TPCK 胰酶的添加終濃度均為0.8 ～1.2μg/ml 時，病毒效價較高。培養(yǎng)過程中由于培養(yǎng)液pH 值的變化，TPCK 胰酶的活性受到影響，病毒再次感染受限。病毒培養(yǎng)96h 后補(bǔ)加終濃度為1μg/ml 的TPCK 胰酶能得到較高效價的病毒。過早補(bǔ)加TPCK 胰酶，會影響細(xì)胞生長狀態(tài)。

除培養(yǎng)條件外，病毒接種量也是影響病毒產(chǎn)量的重要因素。病毒的接種量低，不能完全感染細(xì)胞； 接種量太高，則會形成缺陷干擾顆粒( defective interfering particles，DIP)，影 響 病 毒 正 常 感 染［11］。接 種0.05 ～0.10 MOI 的病毒，培養(yǎng)168h 后收獲病毒效價最高。病毒培養(yǎng)時間過短，病毒未完全從感染的細(xì)胞中釋放，病毒產(chǎn)量較低；培養(yǎng)時間過長，病毒易降解。

綜上所述，本研究在確認(rèn)了H3N2 流感病毒冷適應(yīng)株在無血清適應(yīng)的Vero 細(xì)胞上的感染性后初步優(yōu)化了其無血清培養(yǎng)的條件，為安全有效的流感減毒活疫苗的生產(chǎn)和研發(fā)提供了依據(jù)。

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