小鼠原鈣黏蛋白的多樣性分析及其亞型的克隆與表達(dá)

王武明+索倫+周雨瀟+魯琳+吳強(qiáng)

摘要：原鈣黏蛋白（protocadherin）是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類跨膜蛋白，是鈣黏蛋白家族中最大的亞族。成簇Pcdh基因包含3個串聯(lián)的基因簇——Pcdhα、β、γ，其中Pcdhα和γ分別由14個和22個可變區(qū)及各自共同的恒定區(qū)組成。這種特殊蛋白結(jié)構(gòu)決定了原鈣黏蛋白各亞型在功能上既相似又不完全相同，為了系統(tǒng)研究原鈣黏蛋白各個亞型的功能，本研究對原鈣黏蛋白家族氨基酸序列保守性進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，并據(jù)此設(shè)計特異性的引物來完成原鈣黏蛋白各個亞型的克??；并以原鈣黏蛋白α1基因為例，通過PCR方法成功將其從小鼠大腦中克隆并構(gòu)建到帶有Myc標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3.1上；利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將該基因成功表達(dá)于293T細(xì)胞。本研究結(jié)果將為后續(xù)其他亞型的克隆建立技術(shù)平臺。

關(guān)鍵詞：原鈣黏蛋白；基因；克隆；小鼠；亞型；氨基酸序列

中圖分類號：Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0034-03

根據(jù)原鈣黏蛋白在基因組上的排布可以分為非成簇原鈣黏蛋白和成簇原鈣黏蛋白，成簇原鈣黏蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，是鈣黏蛋白超家族中最大的一個亞家族[1]。成簇原鈣黏蛋白包含3個串聯(lián)基因簇——α、β、γ[2]。其中原鈣黏蛋白α和γ分別由14個和22個可變區(qū)及各自共同的恒定區(qū)組成，并通過基因的可變剪接編碼成36種原鈣黏蛋白分子，而原鈣黏蛋白β的22個成員僅分別由1個外顯子編碼而成[2]。研究表明，原鈣黏蛋白在神經(jīng)突觸發(fā)育過程中起直接作用，作為黏附分子加強(qiáng)神經(jīng)突觸的連接，在突觸特異性形成過程中也發(fā)揮重要作用[3]。原鈣黏蛋白根據(jù)其胞內(nèi)段的差異可以分為A類型和B類型，A類型在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和海馬5-羥色胺總量上起重要的作用[4]，原鈣黏蛋白α和γ負(fù)調(diào)控PYK2活性，依賴胞內(nèi)區(qū)與PYK2結(jié)合[5]，并通過PYK2-RhoGTPase通路調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架從而影響神經(jīng)元樹突發(fā)育[6]，結(jié)果表明，原鈣黏蛋白經(jīng)由調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附來建立神經(jīng)元連接。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約60多種原鈣黏蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)[7]。原鈣黏蛋白與典型的鈣黏蛋白一樣，由6個胞外EC結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成，各亞型在結(jié)構(gòu)上高度相似，在氨基酸序列上卻不完全相同[2，8]。眾多研究結(jié)果表明，原鈣黏蛋白各個亞型在神經(jīng)元發(fā)育過程中分別發(fā)揮著獨特的作用。為了系統(tǒng)探索各個亞型的作用，本研究通過軟件分析原鈣黏蛋白α家族氨基酸序列保守性，以原鈣黏蛋白α1基因為例將其構(gòu)建到pcDNA3.1載體并順利表達(dá)，結(jié)果將為原鈣黏蛋白其他亞型克隆及其后續(xù)功能研究建立技術(shù)平臺。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和表達(dá)載體真核表達(dá)載體pcDNA3.1（—）mycHisA購自Invitrogen；293T細(xì)胞系由上海交通大學(xué)腫瘤所實驗室贈送。

1.1.2試劑和酶類Tris堿、甘氨酸、過硫酸銨和十二烷基磺酸鈉購自Sigma-Aldrich公司。無水乙醇、甲醇、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TRIzolReagent購自Gibco（lifetechnologies）公司；胰化蛋白胨與酵母提取物購自O(shè)xoid公司；RT-PCR試劑盒、電泳級瓊脂糖和核糖核酸酶購自Promega公司；質(zhì)粒小抽和膠回收試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒中抽試劑盒購自Qiagen公司。30%Acr/Bis儲備膠溶液和封閉用脫脂奶粉，購自Bio-Rad公司；胰蛋白酶和胎牛血清購自Gibco公司；100bpDNALaddermarker、1kbDNALaddermarker購自寶生物工程（大連）有限公司；Opti-MEMI液體培養(yǎng)基、Lipofectamine2000、蛋白markerSeebluePlus2PrestainedStandard購自Invitrogen公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NewEnglandBiolabs公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自碧云天公司。

1.1.3引物本試驗所用引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成上游引物PF：5′-AGCTCGAGCTCGATACGGAAAGTGCAGTAC-3′包含1個XhoⅠ酶切位點。

下游引物PR：5′-AGCAAGCTTACACTGGTCACTGTTGTCCGT-3′包含1個HindⅢ酶切位點。

1.1.4抗體mouseanti-Myc（Millipore），mouseanti-β-actin（Abcam），mouseanti-protocadherinα由艾比瑪特公司定制生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取

取小鼠大腦組織50～100mg，加1mLTRIzol試劑，在冰上將組織搗碎，12000r/min，4℃離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另外無核酸酶的離心管里，室溫孵育5min，然后加0.2mL氯仿，急劇搖晃15s，室溫孵育3min，12000r/min，4℃離心15min，轉(zhuǎn)移分界面上層無色液體到另外離心管中，加0.5mL異丙醇沉淀RNA，室溫放置10min，12000r/min，4℃離心10min，去除上清液，加1mL75%乙醇洗RNA沉淀，然后7500r/min，4℃離心5min，去除上清，加無核酸酶的水溶解RNA沉淀。

1.2.2RT-PCR

運用2步法，第1步首先合成cDNA：取1μg總RNA，70℃，10min，簡單離心后放置在冰上。準(zhǔn)備20μL反應(yīng)體系，包括4μL25mmol/LMgCl2，逆轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2μL，10mmol/LdNTP混合液2μL，重組RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶15U，Oligo（dT）15引物或隨機(jī)引物0.5μg，總RNA1μg，加無核酸酶的水到20μL體積。如果用Oligo（dT）15引物擴(kuò)增，將反應(yīng)體系放于42℃，15min；如果用隨機(jī)引物擴(kuò)增，將反應(yīng)體系室溫放置10min，然后放置在42℃，15min。最后95℃熱激樣品5min，放于0～5℃，5min。

第2步PCR：以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以PF、PR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，57℃退火30s，68℃延伸3min，30個循環(huán)；最后68℃7min。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒回收純化。

1.2.3重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Myc-Pcdhα1的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增原鈣黏蛋白α1經(jīng)電泳、膠回收純化后用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ消化，連接到用同樣酶切割了多克隆位點的pcDNA3.1載體上。

1.2.4JM109感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用氨芐抗性平板篩選克隆。

1.2.5菌落PCR鑒定、酶切鑒定和測序

菌落PCR挑取單克隆菌落，稀釋于10L滅菌水中，以1L菌液為模板，配成10L反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s，57℃退火30s，68℃延伸3min，26個循環(huán)；最后68℃7min。菌落PCR鑒定正確后，將剩余的9L菌液小搖擴(kuò)繁，第2天小抽提取質(zhì)粒。

酶切鑒定測定小抽質(zhì)粒濃度，酶切體系：質(zhì)粒200ng，10×BSA0.5μL，10×酶切緩沖液0.5μL，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ0.3μL，HindⅢ0.3μL，加無菌水至5μL，放于37℃，1h。瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。酶切鑒定正確后測序。

1.2.6重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中表達(dá)

將鑒定正確的重組菌用含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。14～16h后，收獲菌液，中抽質(zhì)粒。用6孔板培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%時，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48h后收獲細(xì)胞。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，蛋白懸浮液4℃，12000r/min離心20min。取上清加2×Loadingbuffer99℃煮5min，用于蛋白質(zhì)免疫印跡試驗。

2結(jié)果與分析

2.1原鈣黏蛋白α家族多樣性分析

利用DNAMAN軟件分析原鈣黏蛋白α家族氨基酸序列保守性發(fā)現(xiàn)，由可變外顯子編碼的氨基酸序列保守性較差，尤其在接近跨膜區(qū)的一段胞內(nèi)域，有一段特異性很強(qiáng)的序列，但胞內(nèi)段C端有一段較長的氨基酸序列（150個氨基酸）完全一樣，這種特殊的蛋白結(jié)構(gòu)決定了原鈣黏蛋白各亞型之間在功能上既有其相似性又不完全相同（圖1）。

2.2原鈣黏蛋白α1基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1RT-PCR擴(kuò)增原鈣黏蛋白α1基因以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第1條鏈為模板，以PF、PR為引物PCR，用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，在2800bp左右獲得與目的片段大小相同的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖2所示。

2.2.2菌落PCR鑒定以單克隆菌落為模板，以PF、PR為引物PCR，擴(kuò)增得到2874bp的目的條帶，結(jié)果如圖3所示。

2.2.3重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，過表達(dá)原鈣黏蛋白α1基因，通過Westernblot方法，分別用mouseanti-Myc和mouseanti-protocadherinα抗體檢測，結(jié)果如圖4、圖5所示，在110ku處有1條明顯的蛋白條帶，對照沒有條帶，而β-actin的表達(dá)量幾乎一致，說明α1基因成功表達(dá)。

3結(jié)論與討論

原鈣黏蛋白在脊椎動物中廣泛存在[9]，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[7]，而且包含數(shù)十種亞型[2]，各亞型在神經(jīng)元特異性識別中分別起重要作用[10-11]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，原鈣黏蛋白α和γ家族基因可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和突觸形成[6，12]，這對解釋某些重大神經(jīng)疾病有重要的啟示作用。本研究利用DNAMAN軟件分析了原鈣黏蛋白α家族氨基酸序列保守性，對其蛋白質(zhì)多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)整個家族各亞型在胞內(nèi)區(qū)有一段氨基酸序列完全一樣，但胞外區(qū)和小部分胞內(nèi)區(qū)保守性較差，這決定了各亞型在功能上既有相似性又不完全相同。本研究成功克隆原鈣黏蛋白α1基因并構(gòu)建到pcDNA3.1載體上?？寺≡}黏蛋白α1基因全長，為后期系統(tǒng)研究原鈣黏蛋白各個亞型的作用打下了基礎(chǔ)，是進(jìn)一步深入研究原鈣黏蛋白家族基因的有力工具。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.7mm]

[1]SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，etal.Protocadherins：alargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem[J].EMBOJournal，1993，12（6）：2249-2256.

[2]WuQ，ManiatisT.Astrikingorganizationofalargefamilyofhumanneuralcadherin-likecelladhesiongenes[J].Cell，1999，97（6）：779-790.

[3]WeinerJA，WangXZ，TapiaJC，etal.Gammaprotocadherinsarerequiredforsynapticdevelopmentinthespinalcord[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2005，102（1）：8-14.

[4]FukudaE，HamadaS，HasegawaS，etal.Down-regulationofprotocadherin-alphaAisoformsinmicechangescontextualfearconditioningandspatialworkingmemory[J].EuropeanJournalofNeuroscience，2008，28（7）：1362-1376.

[5]ChenJ，LuYY，MengSX，etal.Alpha-andgamma-protocadherinsnegativelyregulatePYK2[J].JournalofBiologicalChemistry，2009，284（5）：2880-2890.

[6]SuoL，LuHN，YingGX，etal.ProtocadherinclustersandcelladhesionkinaseregulatedendritecomplexitythroughRhoGTPase[J].JournalofMolecularCellBiology，2012，4（6）：362-376.

[7]ZouC，HuangW，YingG，etal.Sequenceanalysisandexpressionmappingoftheratclusteredprotocadheringenerepertoires[J].Neuroscience，2007，144（2）：579-603.

[8]WuQ，ZhangT，ChengJF，etal.ComparativeDNAsequenceanalysisofmouseandhumanprotocadheringeneclusters[J].GenomeResearch，2001，11（3）：389-404.

[9]WuQ.Comparativegenomicsanddiversifyingselectionoftheclusteredvertebrateprotocadheringenes[J].Genetics，2005，169（4）：2179-2188.

[10]LefebvreJL，KostadinovD，ChenWV，etal.Protocadherinsmediatedendriticself-avoidanceinthemammaliannervoussystem[J].Nature，2012，488（7412）：517-521.

[11]ChenWV，AlvarezFJ，LefebvreJL，etal.Functionalsignificanceofisoformdiversificationintheprotocadheringammagenecluster[J].Neuron，2012，75（3）：402-409.

[12]GarrettAM，SchreinerD，LobasMA，etal.gamma-ProtocadherinscontrolcorticaldendritearborizationbyregulatingtheactivityofaFAK/PKC/MARCKSsignalingpathway[J].Neuron，2012，74（2）：269-276.

[5]ChenJ，LuYY，MengSX，etal.Alpha-andgamma-protocadherinsnegativelyregulatePYK2[J].JournalofBiologicalChemistry，2009，284（5）：2880-2890.

[6]SuoL，LuHN，YingGX，etal.ProtocadherinclustersandcelladhesionkinaseregulatedendritecomplexitythroughRhoGTPase[J].JournalofMolecularCellBiology，2012，4（6）：362-376.

[7]ZouC，HuangW，YingG，etal.Sequenceanalysisandexpressionmappingoftheratclusteredprotocadheringenerepertoires[J].Neuroscience，2007，144（2）：579-603.

[8]WuQ，ZhangT，ChengJF，etal.ComparativeDNAsequenceanalysisofmouseandhumanprotocadheringeneclusters[J].GenomeResearch，2001，11（3）：389-404.

[9]WuQ.Comparativegenomicsanddiversifyingselectionoftheclusteredvertebrateprotocadheringenes[J].Genetics，2005，169（4）：2179-2188.

[10]LefebvreJL，KostadinovD，ChenWV，etal.Protocadherinsmediatedendriticself-avoidanceinthemammaliannervoussystem[J].Nature，2012，488（7412）：517-521.

[11]ChenWV，AlvarezFJ，LefebvreJL，etal.Functionalsignificanceofisoformdiversificationintheprotocadheringammagenecluster[J].Neuron，2012，75（3）：402-409.

[12]GarrettAM，SchreinerD，LobasMA，etal.gamma-ProtocadherinscontrolcorticaldendritearborizationbyregulatingtheactivityofaFAK/PKC/MARCKSsignalingpathway[J].Neuron，2012，74（2）：269-276.

[5]ChenJ，LuYY，MengSX，etal.Alpha-andgamma-protocadherinsnegativelyregulatePYK2[J].JournalofBiologicalChemistry，2009，284（5）：2880-2890.

[6]SuoL，LuHN，YingGX，etal.ProtocadherinclustersandcelladhesionkinaseregulatedendritecomplexitythroughRhoGTPase[J].JournalofMolecularCellBiology，2012，4（6）：362-376.

[7]ZouC，HuangW，YingG，etal.Sequenceanalysisandexpressionmappingoftheratclusteredprotocadheringenerepertoires[J].Neuroscience，2007，144（2）：579-603.

[8]WuQ，ZhangT，ChengJF，etal.ComparativeDNAsequenceanalysisofmouseandhumanprotocadheringeneclusters[J].GenomeResearch，2001，11（3）：389-404.

[9]WuQ.Comparativegenomicsanddiversifyingselectionoftheclusteredvertebrateprotocadheringenes[J].Genetics，2005，169（4）：2179-2188.

[10]LefebvreJL，KostadinovD，ChenWV，etal.Protocadherinsmediatedendriticself-avoidanceinthemammaliannervoussystem[J].Nature，2012，488（7412）：517-521.

[11]ChenWV，AlvarezFJ，LefebvreJL，etal.Functionalsignificanceofisoformdiversificationintheprotocadheringammagenecluster[J].Neuron，2012，75（3）：402-409.

[12]GarrettAM，SchreinerD，LobasMA，etal.gamma-ProtocadherinscontrolcorticaldendritearborizationbyregulatingtheactivityofaFAK/PKC/MARCKSsignalingpathway[J].Neuron，2012，74（2）：269-276.