RP－HPLC 測定苧麻不同部位中3 個三萜酸異構(gòu)體的含量

鄒盛勤，周蘭姜

(江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

苧麻Boehmeria nivea(L. )Gaud. 是蕁麻科苧麻屬植物，又名野麻、野苧麻等，廣泛分布于我國南方地區(qū)，生于山谷林邊或草坡，是重要的水土保持植物和民間草藥，以湖北、湖南、江西及四川為最多，其中長江流域產(chǎn)量占我國總產(chǎn)量的90%以上。［1］苧麻主要以葉、根入藥， 《本草綱目》記載苧麻“甘，寒，無毒”，具有涼血、止血、散瘀的功效，主治跌撲瘀血，創(chuàng)傷出血等。［2］

研究表明，苧麻根、葉具有廣泛的生物活性，止血和安胎效果優(yōu)良，且有防治心腦血管疾病和治療肝、肺疾病的藥效作用。［1，3］文獻(xiàn)報道苧麻屬植物主要含有三萜酸類、黃酮類、蒽醌類、有機酸和生物堿類等化學(xué)成分，［4－7］其中三萜酸類成分種類豐富，含有坡模酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等及其衍生物。［8］但目前苧麻作為藥用資源，其相應(yīng)的研發(fā)基礎(chǔ)主要集中于化學(xué)成分的分離及定性鑒別，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，嚴(yán)重影響其開發(fā)利用。本實驗結(jié)合參考文獻(xiàn)，建立了RP－HPLC 同時測定苧麻不同部位中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，為苧麻藥材的開發(fā)利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

乙 腈 為 色 譜 純 (J＆K SCIENTIFIC LTD. )，95%乙醇為分析純(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水，白樺脂酸對照品(批號10039－200812，南昌貝塔生物科技有限公司)，齊墩果酸對照品(批號110709－201106，中國食品藥品檢定研究院)，熊果酸對照品 (批號110742－201304，中國食品藥品檢定研究院)。苧麻于2013年11 月采自江西省宜春市郊(盛花期)，經(jīng)鑒定為蕁麻科植物苧麻Boehmeria nivea (L. )Gaud. 的全草。

1.2 儀器

Waters 高效液相色譜儀(515 泵，2996 光電二極管陣列檢測器，Empower 中文色譜數(shù)據(jù)工作站);HP－DR05 高純水機(上海廣創(chuàng)通用設(shè)備有限公司);CP225D 準(zhǔn)微量天平(德國賽多利斯公司);FY177 中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);超聲波清洗器(江西華特精密儀器有限公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸檢測波長的確定

采用PAD 檢測器對白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品溶液進行全波段掃描，流動相中3 組分均在201.0nm 左右有最大紫外吸收，但在此波長處乙腈存在較強的末端吸收。［9］為減少噪音影響，提高信噪比，選擇210nm 為檢測波長信噪比高，峰形對稱，在消除噪音干擾的同時白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸均達(dá)到基線分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液

分別準(zhǔn)確稱取白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品7.66mg，1.84mg，4.70mg，置于10mL 棕色容量瓶中，適量流動相溶解，定容，振蕩均勻，制成含白樺脂酸0.766mg/mL，齊墩果酸0.184mg/mL 和熊果酸0.470mg/mL 的對照品混合溶液。

2.2.2 苧麻樣品溶液

取陰干后苧麻不同部位樣品，于75℃下干燥6h，粉碎過篩。取苧麻的花、葉、莖、根和全草粉末樣品，分別約為1.0g，精密稱定，置于50mL 具塞錐形瓶中，加入95%乙醇50mL，稱重，超聲提取45min，冷卻至室溫后用95%乙醇補足損失的重量，振蕩均勻后用0.45μm 微孔濾膜過濾，得樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，流動相為乙腈∶ 水∶ 乙酸(80∶ 20∶ 0.2，v/v)，流速為1.0mL/min，檢測波長210nm，柱溫為25℃。在選定的色譜條件下，對照品和苧麻樣品溶液中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸均實現(xiàn)基線分離，峰形對稱，理論塔板數(shù)均大于11000。對照品及苧麻樣品的HPLC 譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)和苧麻樣品(B)的HPLC 色譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference(A)substances and samples of Boehmeria nivea(B)

2.4 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取對照品混合溶液20μL，連續(xù)進樣5次，通過峰面積來計算出色譜系統(tǒng)的精密度，白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD 分別為0.8% (n=5)，0.7% (n =5)和0.4% (n =5)，儀器精密度良好。

2.5 方法重現(xiàn)性試驗

取同一苧麻葉樣品5 份，每份約1.0g，精密稱定。按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液。準(zhǔn)確吸取各樣品溶液20μL 進樣分析，外標(biāo)法計算白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，其RSD 分別為1.2% (n=5)、1.3% (n =5)和1.5% (n =5)，樣品制備方法重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱定已知白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸含量的苧麻葉樣品6 份，加入約與樣品中3 組分含量相當(dāng)?shù)膶φ掌罚础?.2.2”項下方法制備苧麻樣品溶液，精密吸取20μL 注入高效液相色譜儀，外標(biāo)法計算含量，白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為100.4% (RSD =1.9%)、98.0%(RSD=2.2%)和96.2% (RSD=1.6%)。

2.7 線性關(guān)系試驗

分別精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品混合溶液50、200、500、1000、2000、3000μL 置于10mL 容量瓶中，加流動相至刻度，定容，得白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品混合系列溶液。分別吸取20μL，根據(jù)選定的色譜條件進樣并計算出對照品的峰面積，以對照品的進樣溶度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table.1 Investigation results and linear relations

2.8 樣品含量定量分析

精密吸取不同部位苧麻樣品溶液20μL 進樣，重復(fù)3次，按“2.3”項下選定色譜條件測定樣品中3 個異構(gòu)體的峰面積積分值，外標(biāo)法計算含量。苧麻樣品中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸含量的測定結(jié)果見表2。

表2 苧麻不同部位中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)Table.2 Contents of three triterpenic acids in different parts of Boehmeria nivea (mg/g，n=3)

3 討論

在苧麻的不同部位中，白樺脂酸含量花中最高，為1.517 mg/g，在莖中最低，為0.212mg/g;齊墩果酸含量在葉中最高，為1.750mg/g，在莖中最低，為0.237mg/g;熊果酸含量在葉中最高，為3.875mg/g，在莖中最低，為0.327mg/g。3 個三萜酸(花中白樺脂酸除外)在苧麻中呈規(guī)律性分布，不同部位含量均為葉﹥根﹥花﹥莖，同一部位含量均為熊果酸﹥齊墩果酸﹥白樺脂酸，且含量差異較為明顯，白樺脂酸主要存在于苧麻花中。

本試驗建立的反相高效液相色譜法樣品處理簡單，簡便快速，分離效果好，可同時測定苧麻不同部位中3 個五環(huán)三萜酸異構(gòu)體(白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸)的含量，為苧麻中三萜酸的定量分析及其開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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