參苓白術(shù)散通過(guò)ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 的表達(dá)

李姿慧， 王 鍵* ， 蔡榮林， 劉曉麗， 蔣懷周

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥230038;2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥230038)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其屬于“泄瀉”、“赤沃”、 “大瘕泄”等范疇，脾虛濕困是其主要病機(jī)［1-2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散治療潰瘍性結(jié)腸炎在臨床上應(yīng)用廣泛，且療效顯著［3-4］，但是有關(guān)其作用機(jī)制和途徑的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。前期研究中發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散能顯著增強(qiáng)脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中水通道蛋白(aquaporin，AQP)4 蛋白及mRNA 的表達(dá)［5］，參苓白術(shù)散對(duì)AQP 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能是其發(fā)揮治療效應(yīng)的主要作用機(jī)制之一。為進(jìn)一步探明參苓白術(shù)散治療UC 的作用機(jī)制，本研究通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)特異性抑制劑1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-雙(鄰氨基苯巰基)丁二烯［1，4-Diamino-2，3-dicyano-1，4-bis (o-aminophenylmercapto)butadiene，U0126］ 和p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)特異性抑制劑4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?；交?-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑［4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole，SB203580］ 的干預(yù)，觀察不同抑制劑對(duì)參苓白術(shù)散治療脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠AQP 調(diào)節(jié)變化的作用，探討ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路在參苓白術(shù)散調(diào)控脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 表達(dá)中的作用，為臨床應(yīng)用參苓白術(shù)散治療UC 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，4 ～6周齡，雌雄各半，60 只，體質(zhì)量 (200 ± 20)g(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)SCXK ［蘇］20100004)。

1.2 試劑與藥品U0126 (MEK1/2 抑制劑)、SB203580 (p38MAPK 抑制劑) (碧云天生物技術(shù)研究所)。參苓白術(shù)散方選人參15 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、陳皮9 g、蓮子肉9 g、白扁豆(姜汁浸，去皮)12 g、薏苡仁9 g、縮砂仁6 g、山藥15 g、桔梗6 g、甘草(炒)9 g (安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室)。丙烯酰胺(美國(guó)Sigma 公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas 公司，貨號(hào)00064525);Tris 堿(美國(guó)sigma 公司);熒光定量試劑(日本TaKaRa公司);PVDF 膜(美國(guó)millipore 公司);甲醇(上海中試化工總公司);Trizol Reagent (美國(guó)invitrogen 公司，貨號(hào)15596-026);電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó)Pierce 公司);高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce 公司);甲叉雙丙烯酰胺(美國(guó)AMRESCO 公司);PCR 試劑(美國(guó)Fermentas 公司);DEPC (德國(guó)Ruibio 公司);引物及探針合成(美國(guó)Invitrogen 公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備與給藥方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、參苓白術(shù)散組(簡(jiǎn)稱(chēng)治療組)、SB203580 + 參苓白術(shù)散組和U0126 +參苓白術(shù)散組，每組12 只。脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型采用TNBS/乙醇灌腸結(jié)合環(huán)境與飲食干預(yù)法復(fù)制［6］，造模成功后，參苓白術(shù)散組、U0126 +參苓白術(shù)散組和SB203580 +參苓白術(shù)散組灌胃予參苓白術(shù)散煎劑12 g/(kg·d)(按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“不同動(dòng)物等效劑量折算系數(shù)表”折算)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃予0.9%氯化鈉注射液l0 mL/(kg·d)，連續(xù)14 d。U0126 +參苓白術(shù)散組和SB203580 +參苓白術(shù)散組分別在灌胃前30 min 經(jīng)尾靜脈注射阻斷劑U0126［溶解于二甲基亞砜(DMSO)，按0.1 mg/kg 體質(zhì)量計(jì)算用量］和SB203580 (溶解于DMSO，按1.5 mg/kg 體質(zhì)量計(jì)算用量)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射含相同DMSO 量的PBS 溶液作為對(duì)照。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 mL/kg)，開(kāi)腹截取距大鼠肛門(mén)約8 cm 處的結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗后放入液氮中備測(cè)。每組各取6只大鼠結(jié)腸組織按照Western blot 法操作規(guī)程測(cè)定結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)。

1.5 熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達(dá) 取每組其余6 只大鼠結(jié)腸組織，經(jīng)RNA 的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，在95 ℃10 min，95℃15 s，60 ℃1 min，40 cycles 反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。AQP3:探針5'-CCTCCATGGGCTTC-3'，正向引物5'-GCCTTGTGGTCCTGGTCATT-3'，反向引物5'-GGTTGA CGGCATAGCCAGAAT-3'。βactin:探針5'-CGGCTA CAGCTTCACCACCACGGC-3'，正向引物5'-GAC TACCTCATG AAGATCCTCACC-3'，反 向 引 物 5'-TCTCCTTAA TGTCAC GCACGATT-3'。AQP4:探 針 5'-CCCTGCAGTTATCATG-3'，正向引物5'-TGAATCCAG CTCGATCCTTTG-3'，反向引物5'-TAT CCAGTG GTTTTCCCAGTTTC-3'。采用relative quantification study 法，以2-ΔΔCt為分析指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)均顯著下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與模型組相比，參苓白術(shù)散組大鼠AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);SB203580 +參苓白術(shù)散組與U0126 +參苓白術(shù)散組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)較模型組升高，但與參苓白術(shù)散組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。提示參苓白術(shù)散治療可明顯上調(diào)脾虛濕困型UC 大鼠AQP3、AQP4 蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)阻斷ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路可以在一定程度上降低參苓白術(shù)散的調(diào)節(jié)作用。具體結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 不同處理因素對(duì)大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein

圖2 不同處理因素對(duì)大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)的影響(±s，n=6)Fig.2 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein (±s，n=6)

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達(dá)比較 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達(dá)水平與正常組相比明顯降低，組間有顯著性差異(P ＜0.05)，提示AQP3、AQP4 mRNA 在脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯下降。參苓白術(shù)散組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達(dá)量與模型組相比明顯升高(P ＜0.05)，表明參苓白術(shù)散治療可以顯著提高脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 的表達(dá)水平。SB203580 +治療組與U0126 +治療組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 mRNA 表達(dá)較模型組有較小幅度升高，但是仍明顯低于參苓白術(shù)散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 不同處理因素對(duì)大鼠結(jié)腸組織AQP3 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=6)Fig.3 Effects of different agents on the expression of AQP3 mRNA (±s，n=6)

圖4 不同處理因素對(duì)大鼠結(jié)腸組織AQP4 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=6)Fig.4 Effects of different agents on the expression of AQP4 mRNA (±s，n=6)

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AQP 廣泛存在于人體肺、胃、腸等器官內(nèi)，AQP 對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用［7-8］，能顯著增加細(xì)胞膜的透水性，對(duì)保持生命體內(nèi)穩(wěn)態(tài)水平衡具有關(guān)鍵的作用［9］。近年來(lái)研究表明，AQP 與中醫(yī)理論的肺、脾、腎等功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，脾胃濕熱證的發(fā)生與AQP3、AQP4 的表達(dá)水平有一定的關(guān)系［10-11］，且慢性淺表性胃炎脾胃濕熱型患者中濕重于熱者的AQP3 表達(dá)多為陽(yáng)性，提示AQP3 的異常表達(dá)可能參與了脾胃濕熱證的發(fā)生機(jī)制［12］。周正等［13］的研究同時(shí)證實(shí)，脾胃濕熱證的發(fā)生與AQP4 的異常表達(dá)亦密切相關(guān)。王曉玲［14］的研究發(fā)現(xiàn)腹瀉狀態(tài)下，大鼠結(jié)腸組織AQP4 的表達(dá)呈異常低表達(dá)狀態(tài)，可能是AQP 的異常表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸對(duì)腸腔內(nèi)的水分吸收減少，從而引起大便溏薄［15］。另外，在前期研究發(fā)現(xiàn)脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織的SOD 活性顯著下降，MDA 水平明顯升高［16］，血清IFN-γ 水平升高，血清IL-4 水平降低［17］，結(jié)腸組織AQP4 蛋白及mRNA 表達(dá)量減少［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 均呈異常低表達(dá)，提示脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 表達(dá)顯著降低，水通道蛋白的表達(dá)異?？赡苁菨癫〉闹匾獧C(jī)制之一。參苓白術(shù)散治療后大鼠AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 水平較脾虛濕困型UC 大鼠顯著升高，表明參苓白術(shù)散治療能夠調(diào)節(jié)機(jī)體水通道蛋白表達(dá)水平，參苓白術(shù)散對(duì)UC 的治療作用與其對(duì)AQP 表達(dá)水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。

ERK1/2、p38MAPK 是MAPK 信號(hào)通路的重要成員，分別具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化和調(diào)節(jié)炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)的作用。前期研究［18］發(fā)現(xiàn)ERK、p38MAPK 蛋白在脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，參苓白術(shù)散能顯著降低結(jié)腸組織ERK、p38MAPK 的表達(dá)水平。有研究表明AQP 的表達(dá)與MAPK 信號(hào)通路的激活密切相關(guān)［19-20］。師 忠 芳 等［21］發(fā) 現(xiàn)，應(yīng) 用U0126 阻 斷MAPK 信號(hào)通路，抑制ERK1/2 的磷酸化和激活，對(duì)損傷刺激所引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA 表達(dá)的下調(diào)有拮抗作用，研究認(rèn)為MAPK 信號(hào)通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)有重要作用［22］。SB203580 是p38MAPK 信號(hào)通路特異性抑制劑，能通過(guò)抑制MAPK 酶活性，抑制后續(xù)MAPKAPK-2 和MAPKAPK-3 的激活，從而調(diào)控炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生［23］。王耀輝等［24-25］研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK 參與了大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達(dá)上調(diào)及腦水腫形成，P38 抑制劑SB203580 可減輕大鼠腦缺血再灌注后AQP4 表達(dá)及腦水腫，其機(jī)制可能與SB203580 抑制p38MAPK 的激活降低了下游AQP4 的表達(dá)有關(guān)。馬小燕等［26］發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參注射液可通過(guò)激活MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路上調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞中AQP3 的表達(dá)水平，U0126 可通過(guò)抑制MAPK 信號(hào)通路下調(diào)AQP3 的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB203580 +治療組與U0126 +治療組大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達(dá)較模型組有較小幅度升高，但與正常組及參苓白術(shù)散組相比均有顯著性差異(P ＜0.05)。提示參苓白術(shù)散可顯著改善大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達(dá)，ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路參與了參苓白術(shù)散對(duì)脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

綜上可見(jiàn)，脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 呈異常低表達(dá)，參苓白術(shù)散能夠顯著提高脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表達(dá)水平，通過(guò)阻斷ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路可以在一定程度上降低參苓白術(shù)散的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究結(jié)果認(rèn)為參苓白術(shù)散治療脾虛濕困型UC 的可能機(jī)制是通過(guò)抑制結(jié)腸組織ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路的激活，從而調(diào)控AQP 的表達(dá)水平，促進(jìn)脾主運(yùn)化水液功能的恢復(fù)和改善機(jī)體水液代謝功能的作用。但是由于引起AQP 表達(dá)變化的原因眾多，其他信號(hào)通路亦可能參與了參苓白術(shù)散對(duì)AQP 的調(diào)節(jié)，各種生理病理狀況下、AQP 表達(dá)調(diào)控的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。參苓白術(shù)散治療脾虛濕困型UC 的調(diào)控機(jī)制及對(duì)MAPK信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步深入研究。

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