兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性及其化學(xué)成分的比較研究

羅 茜， 馬桂芝， 單 萌， 王 娟， 于富生， 滕 亮， 王長虹

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊830011；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性及其化學(xué)成分的比較研究

羅 茜1， 馬桂芝1， 單 萌1， 王 娟1， 于富生2， 滕 亮3，4*， 王長虹4*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊830011；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

目的對兩種阿魏揮發(fā)油的急性毒性和化學(xué)成分進(jìn)行比較研究。方法將兩種阿魏揮發(fā)油系列濃度乳劑分別給予小鼠一次性灌胃，觀察給藥后小鼠的毒性反應(yīng)和死亡情況。以小鼠死亡率為指標(biāo)，采用Bliss法測定兩種揮發(fā)油對小鼠的半數(shù)致死量，比較兩種阿魏揮發(fā)油的毒性。采用GC-MS對兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油LD50=10 240 mg/kg；五彩阿魏揮發(fā)油LD50=491.61 mg/kg，試驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀。五彩阿魏揮發(fā)油中共鑒定出22種化合物，硫化合物含有量超過揮發(fā)油總量的60%；阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油中共鑒定出50種化合物，未檢出含硫化合物。結(jié)論阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性較小，中毒癥狀較輕。兩種阿魏化學(xué)成分種類及含有量差異較大，可能是其毒性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。

阿勒泰多傘阿魏；五彩阿魏；揮發(fā)油；化學(xué)成分；急性毒性

阿魏為傘形科植物阿魏Ferula assafoetida L.、新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen、寬葉阿魏Ferula conocaula Eug.的樹脂，對血液循環(huán)、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)都有影響，具有消積、殺蟲、祛濕、止痛之功效，可用于治療心腹冷痛、慢性腸胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。阿魏主要生長于多沙地帶，分布于前蘇聯(lián)中亞細(xì)亞地區(qū)及伊朗、阿富汗。樹脂外表暗黃色或黑棕色，貯藏日久則變?yōu)榧t棕色，新的破折面為乳白色或淺黃棕色，或紅棕色交錯(cuò)，通稱為 “五彩阿魏”。新疆阿魏、寬葉阿魏則主要分布于新疆［1-5］。

歷版 《中華人民共和國藥典》都收載了新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen和阜康阿魏Ferula fukanensis K. M.Shen［6］。近年來由于開荒造田、筑路、水源斷流、干旱、濫采濫挖等原因?qū)е掳⑽荷L面積大幅度縮小，已無商品藥材可提供?！吨袊湎l危保護(hù)植物名錄》中新疆阿魏被列為三級重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物，國務(wù)院發(fā)布的 《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》中，新疆阿魏被列為二級保護(hù)重要野生藥材物種。在藥用阿魏資源匱乏的情況下，尋找藥典收載阿魏的替代藥材迫在眉睫。

在國產(chǎn)阿魏的產(chǎn)地新疆，除了具有蒜臭樣氣味的臭阿魏，還大量存在著不具有蒜臭味的香阿魏，并在民間習(xí)用多年。香阿魏為傘形科植物多傘阿魏Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.的樹脂或根，在維吾爾、哈薩克等民族民間中用于治療心腹冷痛、腹部腫塊、慢性腸胃炎、蟲積、肉積、慢性支氣管炎及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥，調(diào)研發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量及價(jià)格與藥典收載阿魏相比均有很大的優(yōu)勢，對其深入研究具有潛在的環(huán)境價(jià)值與經(jīng)濟(jì)意義。

課題組在前期優(yōu)選了新疆阿魏［7］、新疆奇臺(tái)產(chǎn)多傘阿魏［8］、新疆阿勒泰產(chǎn)多傘阿魏與五彩阿魏揮發(fā)油的提取工藝 （新疆阿勒泰產(chǎn)多傘阿魏的提取工藝優(yōu)選與五彩阿魏揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)選將另文進(jìn)行報(bào)道），結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種阿魏揮發(fā)油外觀與理化性質(zhì)差別較大。本實(shí)驗(yàn)對阿勒泰多傘阿魏 （香阿魏）和五彩阿魏 （臭阿魏）揮發(fā)油的急性毒性作比較，并將其化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，為后續(xù)阿魏藥材的替代研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 7890 A-5975C型，美國）；電子天平 （BS110S，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）；智能恒溫電熱套（DRT-SX型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；揮發(fā)油提取器 （江蘇鑒湖玻璃儀器廠）。1.2 試劑與藥材 吐溫80（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20110411）；大豆油 （中糧食品營銷有限公司，批號20130522）；丙酮 （天津永晟精細(xì)化工有限公司，20111020）；無水硫酸鈉 （天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠，050810）；阿勒泰多傘阿魏 （Ferula ferulaeoidis（Steud.）Korov.，批號20140327，購于烏魯木齊華泰輝煌商貿(mào)有限公司，由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為多傘阿魏的樹脂）；五彩阿魏 （Ferula assafoetida L.），批號20120508，購于安徽亳州蕉城區(qū)豐水源劉莊，由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為五彩阿魏的樹脂）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠 （KM小鼠），體質(zhì)量為18～22 g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（新）2011-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 兩種阿魏揮發(fā)油的提取

2.1.1 五彩阿魏揮發(fā)油的提取 稱取五彩阿魏50 g，加入6.5倍水，提取5 h，冷卻，收集揮發(fā)油，采用無水硫酸鈉干燥，即得。

2.1.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的提取 稱取阿勒泰多傘阿魏50 g，加入14倍水，提取7 h，趁熱收集揮發(fā)油，冷卻，即得。

2.2 兩種阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn)［9］

2.2.1 兩種阿魏揮發(fā)油乳劑的制備 采用濕膠法制備揮發(fā)油乳劑，以吐溫80作為乳化劑，將兩種阿魏揮發(fā)油分別溶于一定量大豆油中作為油相，分次加入到含有乳化劑的水相中，用力研磨使成初乳，再加水稀釋至一定量，配制成所需濃度的揮發(fā)油乳劑。初乳中油、水、乳化劑的比例為4∶2∶1。

2.2.2 多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn) 小鼠灌胃給予含多傘阿魏揮發(fā)油的乳劑，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其對小鼠的最大致死劑量為16 000 mg/kg，最小致死劑量為6 500 mg/kg。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在正式試驗(yàn)中將50只KM小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，以16 000 mg/kg為初始劑量，組間劑量比值K為0.8，按1∶0.8等比稀釋法配制系列濃度多傘阿魏揮發(fā)油乳劑，各組小鼠按0.2 mL/10 g體質(zhì)量一次性灌胃給藥 （給藥前禁食不禁水12 h），給藥后連續(xù)觀察14 d，詳細(xì)記錄各組小鼠毒性反應(yīng)和死亡情況。采用Bliss軟件計(jì)算半數(shù)致死量 （LD50），結(jié)果見表1。

表1 多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果多傘阿魏揮發(fā)油LD50為10 240 mg/kg，LD50的95%可信限為9 140.4～11 472 mg/kg。

2.2.3 五彩阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn) 小鼠灌胃給予含五彩阿魏揮發(fā)油的乳劑，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其對小鼠的最大致死劑量為900mg/kg，最小致死劑量為200 mg/kg。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在正式試驗(yàn)中將KM小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。以900 mg/kg為初始劑量，組間劑量比值K為0.78，按1∶0.78等比稀釋法配制系列濃度五彩阿魏揮發(fā)油乳劑。各組小鼠按0.2 mL/10 g體質(zhì)量一次性灌胃給藥 （禁食不禁水12 h），即刻觀察給藥后各組出現(xiàn)的中毒反應(yīng)及死亡情況，連續(xù)觀察14 d，詳細(xì)記錄各組小鼠毒性反應(yīng)及死亡情況，采用Bliss軟件計(jì)算半數(shù)致死量（LD50），結(jié)果見表2。

表2 五彩阿魏揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果五彩阿魏揮發(fā)油的LD50為491.61 mg/kg，95%可信限為422.39～577.8 mg/kg。

2.3 兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析

2.3.1 樣品制備

2.3.1.1 五彩阿魏揮發(fā)油 精密量取五彩阿魏揮發(fā)油1mL，置10mL量瓶中，丙酮定容至刻度，即得。

2.3.1.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油 精密稱取揮發(fā)油0.1 g，置10 mL量瓶中，丙酮溶解并定容至刻度，即得。

2.3.2 氣相色譜質(zhì)譜分析條件

2.3.2.1 氣相色譜條件［10］氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent7890 A-5975C型，美國）；HP-5MS毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm× 0.25μm）；載氣為高純氮?dú)?；載氣體積流量為1 mL/min；進(jìn)樣量0.5μL；分流比30∶1；進(jìn)樣器250℃；檢測器250℃；起始溫度為60℃，保持2 min，以2℃/min的速率程序升溫至120℃，保持5 Min，最后以4℃/min升溫至180℃，保持5 min。

2.3.2.2 質(zhì)譜條件 電離方式EI；電離能量70 eV；離子源發(fā)生器溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍30～350 amu。

2.3.3 氣相色譜質(zhì)譜分析結(jié)果

2.3.3.1 五彩阿魏揮發(fā)油 五彩阿魏揮發(fā)油的總離子流圖見圖1。采用面積歸一化法以計(jì)算出各組分的相對含有量，經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫檢索，確定了阿魏揮發(fā)油的基本化學(xué)成分，共鑒定出22種化合物，其中主要成分為 （1R）-α-蒎烯（5.06%）、1，2-二硫戊烷 （61.46%）、2，2-雙 （甲硫基）-丙烷 （10.465%）、 （E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯（3.528%）、（Z）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯 （2.10%）、別羅勒烯 （2.34%）、對乙烯基愈創(chuàng)木醇 （2.771%）、α-桉葉醇 （3.291%）等，含硫化合物含有量超過揮發(fā)油總量的60%。

2.3.3.2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的總離子流圖見圖2。采用面積歸一化法以計(jì)算出各組分的相對含有量，經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫檢索，確定了阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油的基本化學(xué)成分，共鑒定出50種化合物，其中主要成分為愈創(chuàng)木醇 （43.554%）、D-檸檬烯 （5.365%）、（1S-內(nèi)型）-1，7，7-三甲基-二環(huán) ［2.2.1］庚-2-醇乙酸酯（6.791%）、反 式-橙花叔 醇 （4.207%）、α-桉葉醇（6.556%）、 （2R-順式）-2R-1，2，3，4，4a，5，6，7-八氫-ππ4a，8-四甲基-2-萘甲醇 （5.053%）等。未檢出多硫化合物。

圖1 五彩阿魏揮發(fā)油總離子流圖

圖2 阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油總離子流圖

2.3.4 兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分比較 兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的比較結(jié)果見表3。

表3 兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果

續(xù)表3

續(xù)表3

3 討論

3.1 關(guān)于急性毒性試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)階段考察了不加藥物的空白乳劑對小鼠的毒性，結(jié)果表明在相同劑量與觀察時(shí)間段內(nèi)，小鼠灌服空白乳劑后行為活動(dòng)正常，未顯示出明確的急性毒性，提示制備乳劑所用的材料對小鼠健康狀態(tài)基本無影響，可以應(yīng)用于阿魏揮發(fā)油乳劑的制備中。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明兩種阿魏揮發(fā)油均具有一定毒性。多傘阿魏揮發(fā)油給藥后，高劑量組小鼠短期內(nèi)俯臥不動(dòng)，呼吸頻率減慢，瞳孔縮小，對外界刺激反應(yīng)能力降低，24 h左右可觀察到小鼠尾部間歇性翹起，24 h后動(dòng)物陸續(xù)死亡；低劑量組小鼠給藥后行動(dòng)緩慢，牽張反射減弱，不能站立，死亡的小鼠無明顯的尾部翹起現(xiàn)象。五彩阿魏揮發(fā)油給藥后，高劑量組小鼠1 h內(nèi)即出現(xiàn)強(qiáng)直性抽搐現(xiàn)象，腹式呼吸明顯，4 h內(nèi)即可出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；低劑量組小鼠給藥后腹式呼吸明顯，無明顯抽搐現(xiàn)象。兩種阿魏揮發(fā)油中毒死亡小鼠的尸解結(jié)果顯示未見器官明顯病變。根據(jù)毒性反應(yīng)情況，提示一定劑量的阿魏揮發(fā)油對小鼠的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等有一定的毒性作用，并且劑量不同時(shí)，中毒反應(yīng)情況不同。相較而言，阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油急性毒性較小，中毒癥狀較輕。

3.2 兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的比較 將兩種阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果進(jìn)行比較研究，可以發(fā)現(xiàn)兩種阿魏均含有蒎烯、α-水芹烯、（E）-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、α-桉葉醇等化合物。五彩阿魏揮發(fā)油中含蒎烯、對乙烯基愈瘡木酚、γ-桉葉醇等，并伴有多種硫化物，其中1，2-二硫戊烷約占60%以上，文獻(xiàn)調(diào)研表明臭阿魏揮發(fā)油因含多硫化合物而具有強(qiáng)烈蒜樣臭味［11］，而多傘阿魏揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果表明鑒定出的化合物中不含多硫化合物，與提取物無蒜臭氣味相一致。其主要成分為單萜及倍半萜類衍生物，如愈創(chuàng)木醇、α-桉葉醇等，該類化合物多具有消炎抗菌及解痙鎮(zhèn)痛作用，這有可能是多傘阿魏在民間藥用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。多傘阿魏鑒定出的化合物成分組成及主要成分的百分含有量與文獻(xiàn)報(bào)道的香阿魏化學(xué)成分［12-14］不完全一致，這可能與產(chǎn)地、采期、測試儀器的條件有關(guān)。而多傘阿魏中含有量高達(dá)43.554%的愈創(chuàng)木醇在五彩阿魏中未檢測到，文獻(xiàn)調(diào)研表明愈創(chuàng)木醇主要存在于愈創(chuàng)木油中，愈創(chuàng)木油是一種常溫下為固態(tài)的精油，而在阿魏揮發(fā)油提取過程中發(fā)現(xiàn)，五彩阿魏常溫下為液態(tài)，而阿勒泰多傘阿魏揮發(fā)油在常溫下則完全為固態(tài)，因此可以初步推測愈創(chuàng)木醇的含有量變化可能是兩種阿魏揮發(fā)油室溫狀態(tài)不同的主要原因。王春娟等［15］對阿魏提取物殺蟲抑菌活性進(jìn)行了初步研究，并以殺蟲活性跟蹤為指導(dǎo)確定了愈創(chuàng)木醇是其主要?dú)⑾x活性化合物，根據(jù)兩種阿魏中愈創(chuàng)木醇含有量變化可以推測與五彩阿魏相比，阿勒泰多傘阿魏的抑菌作用應(yīng)該會(huì)比較理想，課題組會(huì)通過后續(xù)研究予以確證。

3.3 急性毒性差異與化學(xué)成分差異的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)合兩種阿魏急性毒性和化學(xué)成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測兩種阿魏化學(xué)成分種類及含有量不同是其毒性不同的主要原因。含硫化合物具有明確的蒜臭味和黏膜刺激性，與多傘阿魏相比，相同劑量情況下，推測五彩阿魏中大量的多硫化合物有可能是其毒性較大的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是目前未見有關(guān)含硫化合物的急性毒性研究報(bào)道，會(huì)在后續(xù)研究中考慮通過提高含硫化合物含有量進(jìn)行小鼠急性毒性，以驗(yàn)證硫化合物含有量與毒性是否相關(guān)，為進(jìn)一步闡明五彩阿魏揮發(fā)油的中毒機(jī)制提供依據(jù)。

［1］趙保勝，桂海水，朱寅獲，等.阿魏化學(xué)成分、藥理作用及毒性研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（17）：279-281.

［2］譚秀芳，李曉瑾，杜翠玲，等.藥用植物阿魏概況及研究進(jìn)展［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2006，15（1）：12-15.

［3］宋東偉，趙文軍，吳雪萍，等.阿魏屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中成藥，2005，27（3）：329-332.

［4］新疆生物土壤沙漠研究所.新疆藥用植物志：第一冊［M］.烏魯木齊：新疆人民出版社，1977：106.

［5］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：上冊［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1993：1186.

［6］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：176.

［7］李 健，滕 亮，徐建軍，等.新疆阿魏揮發(fā)油提取工藝的比較研究［J］.中成藥，2009，31（4）：636-638.

［8］雷林潔，滕 亮，趙 欣，等.多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝及化學(xué)成分研究［J］.中成藥，2013，35（6）：1251-1256.

［9］陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：112-113.

［10］王 珊，柯 瑾，蒲旭峰.阿魏揮發(fā)油成分GC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2008，30（4）：472-475.

［11］Geroushi A.Auzi A A.Elhwuegi A S.et al.Antiinflammatory sesquiterpenes froMthe root oil of Ferula hermonis［J］. Phytother Res，2011，25（5）：774-775.

［12］倪 慧，姜傳義，劉淑蘭，等.新疆多傘阿魏中揮發(fā)油成分報(bào)道［J］.中藥材，1997，20（1）：34-35.

［13］戴 斌，戴向東，丘翠嫦.香阿魏揮發(fā)油成分的研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2004，（68）：173-174.

［14］倪 慧，姜傳義，陳茂齊.新疆多傘阿魏根中揮發(fā)油成分研究［J］.中成藥，2001，23（1）：54-57.

［15］王春娟.阿魏提取物殺蟲抑菌活性的初步研究 ［D］.石河子大學(xué)，2006.

R285.1

：B

：1001-1528（2015）05-1130-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.048

2014-08-08

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 （Y111310035）；新疆維吾爾自治區(qū)科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金 （201253165）；科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金 （12C26216507308）。

羅 茜 （1989—），女，碩士生，從事中藥民族藥新藥研究。Tel：18082890281，E-mail：250545160@qq.com

*通信作者：滕 亮 （1975—），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥民族藥新藥研究。Tel：（0991）4362442，E-mail：tl750212@ 126.com王長虹 （1964—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑與體內(nèi)過程研究。Tel：（021）51322511，E-mail：wchcxm@hotmail.com