聚酰胺固相萃取-HPLC法同時(shí)測(cè)定中藥材中16種合成酸性色素

孫 健， 馮 睿， 胡 青， 于 泓， 張 甦， 方 琳， 諸艷蓉， 毛秀紅， 季 申

（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

聚酰胺固相萃取-HPLC法同時(shí)測(cè)定中藥材中16種合成酸性色素

孫 健， 馮 睿， 胡 青， 于 泓， 張 甦， 方 琳， 諸艷蓉， 毛秀紅， 季 申*

（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

目的針對(duì)中藥材及飲片染色現(xiàn)象，建立同時(shí)測(cè)定金橙Ⅰ、亮藍(lán)G、亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、亮黃、金橙Ⅱ、酸性橙10、赤蘚紅、酸性紅73、莧菜紅、酸性紅18、誘惑紅、曙紅鈉、羊毛綠、酸性黑1等16種合成酸性色素的HPLC檢測(cè)方法。方法樣品用甲醇-0.1%甲酸溶液提取后，再經(jīng)聚酰胺固相萃取去除大部分基質(zhì)干擾，采用Agilent ZORBAX C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以甲醇-20 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫，以二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定。結(jié)果在丹參、山茱萸、槐米、黃連四種基質(zhì)中，這16種色素在50 ng/mL至50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其中前14種色素可定量，定量檢測(cè)限為1.13～8.77 mg/kg，回收率為61.4%～112.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～5.4%。結(jié)論本方法適用范圍廣，已應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定。

聚酰胺固相萃取；高效液相色譜；中藥材；酸性色素

近年來，中藥材及其飲片非法染色現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。研究表明，合成色素具有不同程度的致敏性和致癌性［1］，雖然其中有不少為允許使用的食用色素，但中藥材監(jiān)管規(guī)定，禁止添加任何合成色素。然而，由于色素品種眾多，而且部分藥材使用多種色素染色，現(xiàn)有國(guó)家藥品檢驗(yàn)方法難以囊括所有情況，因此須完善和補(bǔ)充以滿足監(jiān)管需要。目前文獻(xiàn)報(bào)道的多種色素同時(shí)測(cè)定大多局限于食品領(lǐng)域［2-7］，但中藥材基質(zhì)因其特殊性和復(fù)雜性，關(guān)于其染色的文獻(xiàn)報(bào)道較少［8-11］，而且大多僅適用于個(gè)別藥材，前處理也以70%乙醇超聲提取為主，HPLC基質(zhì)干擾嚴(yán)重限制了方法的通用性?？紤]到HPLC法仍是目前普遍使用的分析手段，故亟需建立起同時(shí)測(cè)定中藥材基質(zhì)多種色素的方法。

常用色素的類型為脂溶性色素、水溶酸性色素、水溶堿性色素。脂溶性色素以蘇丹紅類為主，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其測(cè)定方法［12-14］；水溶性色素大多數(shù)為酸性，為中藥材及飲片最常用的一類色素，但多種合成酸性色素的同時(shí)測(cè)定鮮有報(bào)道。本研究采用聚酰胺固相萃取法，可除去大部分中藥材基質(zhì)干擾，所建立的HPLC法可同時(shí)測(cè)定16種合成酸性色素。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器 （美國(guó)安捷倫公司）；Agilent ZORBAX C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，美國(guó)安捷倫公司）；高速離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf公司）；超聲儀（美國(guó)Branson公司）；聚酰胺SPE柱（1 g，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

甲醇、乙酸銨（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；甲酸、氨水 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；金橙Ⅰ、金橙Ⅱ、羊毛綠、檸檬黃、日落黃、赤蘚紅、酸性紅73、莧菜紅、誘惑紅（瑞士Fluka公司）；亮藍(lán)G、酸性黑1（美國(guó)Sigma公司）；亮藍(lán)、酸性橙10、酸性紅18、曙紅鈉（德國(guó)Dr.E.公司）；亮黃（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水 （自制）。

丹參、山茱萸、槐米、黃連等中藥材購(gòu)自上海市場(chǎng)。

2.2 混合對(duì)照試劑溶液的制備 將16種色素分為兩組，取金橙Ⅰ、亮藍(lán) G、亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、亮黃、羊毛綠、酸性黑1對(duì)照品適量，加水制成每1 mL分別含0.05 mg的混合溶液，作為對(duì)照試劑溶液①；取金橙Ⅱ、酸性橙10、赤蘚紅、酸性紅73、莧菜紅、酸性紅18、誘惑紅、曙紅鈉對(duì)照品適量，加水制成每1 mL分別含0.05 mg的混合溶液，作為對(duì)照試劑溶液②。精密量取對(duì)照試劑溶液適量，用水依次稀釋成質(zhì)量濃度為50μg/mL、10μg/ML、1μg/mL、100 ng/mL、50 ng/mL的系列溶液，作為系列混合對(duì)照試劑工作溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取粗粉 （過二號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，置50 ML具塞離心管中，用甲醇-0.1%甲酸溶液 （3∶2）避光超聲提取 （頻率53 kHz，功率500W），第1次10 mL 30 min，第2次5 mL 15 min，第3次5 mL 15 min，4 000 r/min離心5 min，合并上清液置25 mL棕色量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液 （3∶2）稀釋至刻度，搖勻。

精密取上述溶液5 mL，快速通過聚酰胺小柱（1 g，內(nèi)徑為1 cm，依次用甲醇3 mL和0.1%甲酸溶液3 ML預(yù)洗），用甲醇-氨水-水 （7∶2∶1）8 mL快速洗脫，收集洗脫液，加25%甲酸溶液適量，調(diào) pH至中性，并定容至 10 mL，搖勻，12 000 r/min離心5 min，取上清液即得。

2.4 液相色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX C18，4.6 mm×250 mm，5μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，20 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為400 nm（亮黃）、440 nm（檸檬黃）、490 nm（金橙Ⅰ、日落黃）、520 nm（金橙Ⅱ、赤蘚紅、酸性紅73、莧菜紅、酸性橙10、酸性紅18、誘惑紅、曙紅鈉）、610 nm（酸性黑1、亮藍(lán)G、亮藍(lán)、羊毛綠）。

時(shí)間/ Mi n 流動(dòng)相A / % 流動(dòng)相B / % 5 5 7～1 7 4 5→5 0 5 5→5 0 1 7～2 0 5 0→6 5 5 0→3 5 2 0～3 0 6 5→9 5 3 5→5 3 0～3 2 9 5 5 3 2～3 3 9 5→5 5→9 5 0～7 5→4 5 9 5→3 3～4 0 5 9 5

3 結(jié)果與討論

3.1 合成酸性色素結(jié)構(gòu)及中藥基質(zhì)對(duì)分析的影響

合成酸性色素多為偶氮類化合物，在特殊條件下，可能分解生成二十多種致癌的芳香胺類化合物［15］。本實(shí)驗(yàn)研究的16種色素除赤蘚紅和曙紅鈉外，多為偶氮類，少數(shù)為芳基甲烷類化合物。赤蘚紅、曙紅鈉結(jié)構(gòu)中含羧基，其余14種結(jié)構(gòu)中含磺酸基，故而稱為酸性色素，但多以鹽的形式存在。

由于中藥材含有豐富的纖維，因此該類色素可與藥材牢固結(jié)合，不易提取。同時(shí)，由于藥材中普遍含有天然色素，如果樣品前處理過程中不經(jīng)純化，會(huì)造成檢測(cè)時(shí)基質(zhì)干擾的問題。

3.2 對(duì)照品分組及定性方法 高效液相色譜法的分離度能影響定量準(zhǔn)確性。為易于色譜分離，并考慮到中藥材中極少同時(shí)檢出16種色素，因此以色素色系及檢測(cè)波長(zhǎng)為分組依據(jù)，將16種色素分為兩組，盡可能避免同時(shí)檢出兩組中的色素。實(shí)際檢測(cè)時(shí)，以相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間及二極管陣列光譜，與對(duì)照品比較，確定檢出與否，必要時(shí)可采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證。

3.3 考察基質(zhì)的選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇丹參、山茱萸、槐米、黃連作為研究對(duì)象。取自不同藥用部位和本身含有顏色，具有代表性，能夠考察方法的通用性。

3.4 樣品前處理優(yōu)化 該類化合物在酸性水溶液中溶解性較好，但由于中藥基質(zhì)對(duì)色素的強(qiáng)吸附性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用0.1%甲酸溶液超聲提取效率非常低。考察不同比例甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-氨水-水溶液，結(jié)果采用甲醇-0.1%甲酸溶液（6∶4）時(shí)，大多數(shù)色素的提取效率最高 （見圖1）。

圖1 提取溶劑與16種色素峰面積的關(guān)系Fig.1 Relationship between extraction solventsand peak areas of 16 pigments

樣品若提取后不經(jīng)凈化而直接進(jìn)樣測(cè)定，其所含天然色素對(duì)基質(zhì)干擾嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)比較HLB固相萃取和聚酰胺固相萃取兩種純化方法，最終確定參照食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［15］的聚酰胺法。該方法利用聚酰胺在酸性條件下能夠牢固吸附酸性色素的原理，試樣溶液加檸檬酸調(diào)pH，之后加入聚酰胺粉吸附，裝入垂熔漏斗抽濾，酸性醇溶液洗滌除雜，最后堿性醇溶液洗脫，得到酸性色素。但在藥材中使用該方法時(shí)發(fā)現(xiàn)其提取效率不高，且重復(fù)性差，操作不便，故而優(yōu)化其方法。利用商品化的聚酰胺固相萃取小柱，藥材經(jīng)甲醇-0.1%甲酸溶液 （6∶4）提取后，提取液上樣，大部分脂溶性色素和堿性色素（多為天然色素）隨上樣液流出，而酸性色素吸附在聚酰胺小柱上，再用堿性甲醇溶液洗脫。該方法可純化并富集酸性色素，并且操作方便，重復(fù)性好。

3.5 線性關(guān)系、檢測(cè)限、回收率和精密度 在上述色譜條件下，16種酸性色素的液相色譜圖見圖2。取系列混合對(duì)照試劑工作溶液進(jìn)樣測(cè)定，以各組分峰面積對(duì)濃度繪制曲線，結(jié)果表明，各色素在50 ng/mL至50μg/ML范圍內(nèi)均有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999 3以上。

圖2 16種色素對(duì)照試劑溶液的液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solution of 16 pigments

取4種藥材 （丹參、山茱萸、槐米、黃連），經(jīng)檢測(cè)不含上述16種酸性色素 （見圖3，以含天然色素較多的丹參為例），然后分別添加低 （2 μg/mL）、中（4μg/mL）、高（8μg/mL）3個(gè)水平的色素對(duì)照品溶液，一式3份，共9份，按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法和 “2.4”項(xiàng)液相色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率和精密度 （n=9）。結(jié)果表明，16種色素中除羊毛綠、酸性黑1、赤蘚紅 （槐米基質(zhì)中）外，3種質(zhì)量濃度下加樣的樣品回收率在61.4%～112.0%之間。

圖3 丹參樣品色譜圖Fig.3 ChromatograMs of Salvia saMp le

分析低水平添加溶液的信噪比，計(jì)算羊毛綠和酸性黑1的定性檢測(cè)限 （S/N=3）以及其余14種色素的定量檢測(cè)限 （S/N=10），結(jié)果見表1。

該方法準(zhǔn)確度較高，適用于不同部位的藥材，可滿足禁用物質(zhì)檢查的要求。但其中羊毛綠和酸性黑1由于其受到的干擾大，準(zhǔn)確性差，故僅作為定性篩查方法，暫不列入定量方法中。

3.6 個(gè)別色素準(zhǔn)確性較差的原因 槐米中赤蘚紅回收率僅為34.3%，分析認(rèn)為，聚酰胺通過氫鍵作用吸附，其余色素結(jié)構(gòu)中具有磺酸基等氫鍵作用較強(qiáng)的基團(tuán)，而赤蘚紅結(jié)構(gòu)中僅具有羧基，氫鍵作用較弱。國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)［16］中赤蘚紅采用液液分配法，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)前處理方法優(yōu)化后，丹參、山茱萸和黃連3種藥材基質(zhì)中赤蘚紅的回收率仍可達(dá)到65%以上，僅在槐米中較低，可認(rèn)為該方法在多數(shù)藥材中準(zhǔn)確性仍較高，暫將赤蘚紅列入定量方法。其回收率偏低是否與花類藥材的特性有關(guān)尚需擴(kuò)大基質(zhì)考察范圍方可確定，并作個(gè)性化研究。

羊毛綠和酸性黑1的回收率普遍較差，經(jīng)分析，二者均具有芳胺結(jié)構(gòu)，有一定的堿性，酸性條件下與聚酰胺吸附不強(qiáng)，可隨酸性甲醇溶液流出。此類色素的前處理方法須另作研究，僅作為定性篩查手段，暫不列入定量方法中。

3.7 市場(chǎng)樣品測(cè)定 采用建立的方法，對(duì)五味子、山茱萸、大黃、何首烏、人工牛黃、黃芩、枸杞子、蒲黃、烏梅、丹參、紅花、關(guān)黃柏、延胡索、黃連、茜草、番瀉葉、酸棗仁、片姜黃、雞血藤、松花粉、黃柏、槐米、月季花、花椒、蘇木、青黛、桔梗等27種83批來自正規(guī)渠道的藥材或飲片進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果仍有3種4批檢出多種色素，如表2所示。經(jīng)專屬性更高的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證，與HPLC法結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有通用性，能夠適用于多種中藥材及飲片。其中，五味子中的日落黃色素和何首烏中的亮藍(lán)色素并未被現(xiàn)行國(guó)家藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法所收載，因此該方法能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法和品種的局限。

表1 16種色素測(cè)定的回收率、精密度和檢測(cè)限Tab.1 Recoveries，precision and liMits of detection of 16 pigments

表2 實(shí)際樣品檢出色素結(jié)果Tab.2 List of pigments detected in practical samples

綜上所述，聚酰胺固相萃取法前處理能夠除去大部分基質(zhì)干擾，而HPLC法能夠同時(shí)定性定量測(cè)定中藥材中16種酸性色素，準(zhǔn)確性高，適用范圍廣，但對(duì)個(gè)別回收率低的色素仍需作前處理方法的個(gè)性化研究。如遇到基質(zhì)干擾很嚴(yán)重的藥材品種，或HPLC法無法確證的情況，建議采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證和定量。

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Simultaneous deterMination of sixteen synthetic acid pigments in medicinal Chinese herbs by polyaMide SPE-HPLC

SUN Jian， FENG Rui， HU Qing， YU Hong， ZHANG Su， FANG Lin， ZHU Yan-rong， MAO Xiu-hong， JIShen*
（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai201203，China）

AIMTo develop an HPLCmethod for simultaneously determining sixteen synthetic acid pigments，including orangeⅠ，brilliant blue G，brilliant blue，tartrazine，sunset yellow，brilliant yellow，orangeⅡ，orange G，erythrosin B，acid red 73，amaranth，acid red 18，allura red，eosin，green S，and acid black 1，to distinguish the dyeing froMmedicinal Chinese herbs.METHODSThe samples were extracted by methanol-0.1%formic acid，then purified by polyamide solid phase extraction（SPE）.A reversed phase column，Agilent ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5μm）was used with methanol-20 mmol/L ammoniuMacetate as themobile phase in a gradient elution mode，and the diode array detector was used for the determination.RESULTSSixteen pigments presented in Danshen（Salviamiltiorrhizae Radix et Rhizoma），Shanzhuyu（Corni Fructus），Huaimi（Sophorae Flos）and Huanglian（Coptidis Rhizoma）possessed good linear correlation in the concentration range froM50 ng/ML to 50μg/mL.The first fourteen pigments could be quantified，their quantitative detection limits ranged froM1.13 mg/kg to 8.77 mg/kg，and their recoveries ranged froM61.4%to 112.0%，the RSDs ranged froM1.2%to5.4%.CONCLUSIONThismethod is universal in the determination of synthetic pigments in practical application.

polyamide solid phase extraction（SPE）；HPLC；medicinal Chinese herbs；acid pigments

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1031-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.023

2014-11-04

孫 健 （1985—），男，碩士，藥師，從事中藥及保健食品檢測(cè)與質(zhì)控。E-mail：sunjian-0000@163.com

*通信作者：季 申 （1964—），女，主任藥師，從事中藥和保健食品質(zhì)控與安全性研究。E-mail：jishen2013@163.com