一測多評法測定健脾丸中4種黃酮類成分

劉 圓， 魏惠珍， 龔建平， 俞冰薈， 金浩鑫， 楊世林， 饒 毅*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330006；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006）

一測多評法測定健脾丸中4種黃酮類成分

劉 圓1， 魏惠珍1， 龔建平1， 俞冰薈1， 金浩鑫2， 楊世林1， 饒 毅1*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330006；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌330006）

目的建立以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)的一測多評法，測定健脾丸 （黨參、白術(shù)、陳皮、枳實、山楂、麥芽）中4種黃酮類成分 （蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）。方法來自10個企業(yè)的健脾丸 （濃縮丸和大蜜丸）以甲醇乙酸提取，HPLC分析采用依利特C18柱 （4.6mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-5.7%醋酸水 （31∶69）；體積流量為1.0 mL/min，檢測波長283 nm。結(jié)果4種黃酮類成分在各自進樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，在島津LC 10-AT、Waters 2695-2996和Angilent1260液相色譜系統(tǒng)的相對校正因子重現(xiàn)性良好（RSD＜5%）。以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)的測定結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果相對誤差＜3%。結(jié)論以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)建立的一測多評法可用于健脾丸中4種成分的定量分析和對其進行質(zhì)量評價。

一測多評；健脾丸；相對校正因子；蕓香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

The QAMSmethod established on hesperidin can evaluate the quality of Jianpi Pills.KEY WORDS：quantitative analysis ofmulti-components by singlemarker（QAMS）；Jianpi Pills；relative correction factor（RCF）；narirutin；naringin；hesperidin；neohespridin

健脾丸源于古代經(jīng)典名方，由黨參、炒白術(shù)、陳皮、枳實 （炒）、炒山楂、炒麥芽六味中藥組成的復(fù)方制劑，是常用的消食導(dǎo)滯方劑［1］?！吨袊幍洹?010年版一部中健脾丸含量測定項下以橙皮苷為檢測指標(biāo)［2］，難以體現(xiàn)中醫(yī)的整體作用特點。橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷及蕓香柚皮苷來源于枳實及陳皮［3-6］，本研究選擇健脾丸制劑中上述4種黃酮類成分作為定量測定指標(biāo)［7-8］，旨在研究一測多評法在多成分定量測定中的可行性。由于橙皮苷對照品廉價易得、穩(wěn)定，故本研究以橙皮苷為內(nèi)參物，建立一測多評法［9-12］測定健脾丸中黃酮類成分的分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB104-N萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；AUW2200十萬分之一天平 （日本島津公司）；KQ3200超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；Mili-Q超純水儀（美國Milipore公司）。

1.2 對照品 對照品柚皮苷 （110722-201111，純度 93.2%）、橙 皮 苷 （110721-201115，純 度95.3%）、 新 橙 皮 苷 （111857-201102， 純 度99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院，對照品蕓香柚皮苷 （130817，純度99.5%）購自南昌品正貿(mào)易有限公司。

1.3 試藥 樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

1.4 試劑 甲醇 （色譜純，上海振興化工一廠）；36%乙酸（分析純，汕頭市西隴化工廠）；Milipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理 在一定的線性范圍內(nèi)，成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測器響應(yīng)成正比。即：W=f× A［13-14］。在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，以藥材 （或制劑）中某一典型成分為內(nèi)參物 （s），建立內(nèi)參物與其他待測成分間的相對校正因子 （RCF，fs/i）［14］，計算公式為：待測成分濃度計算公

式中Ai為供試品中待測成分i的峰面積，Ci為供試品中待測成分i的濃度，As為供試品中內(nèi)參物s的峰面積，Cs為供試品中內(nèi)參物s的濃度。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蕓香柚皮苷對照品9.79 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密稱取柚皮苷對照品8.90 mg、新橙皮苷對照品9.59 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密稱取橙皮苷對照品4.95 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密量取1 mL蕓香柚皮苷、1 mL柚皮苷、1 mL橙皮苷、1 mL新橙皮苷對照品貯備液置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取健脾丸濃縮丸或取重量差異檢查項下的大蜜丸，切碎，混勻，取約0.5 g，精密稱定，加硅藻土0.5 g，研勻，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 （功率220W，頻率50 kHz）5min，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 依利特色譜柱 （4.6 mm×250 mm，填料為Hypersil ODS 5μm，柱號E2313293，批號11187）；流動相為甲醇 （A）-5.7%醋酸水（B）（31∶69），體積流量1.0 ML/min，進樣體積10μL，檢測波長283 nm，柱溫為室溫。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗 精密量取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，在上述色譜條件下進樣分析。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對照品保留時間相同的色譜峰；蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.97～1.10間，理論板數(shù)以橙皮苷計大于3 000，陰性對照在相應(yīng)位置處未見色譜峰，方法專屬性良好?；旌蠈φ掌?、樣品及陰性樣品HPLC見圖1。

圖1 混合對照品 （A）、樣品 （B）及缺陳皮、枳實的陰性樣品（C）HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of Mixed reference substances（A）、sample（B）and samplewithout Citri Reticulatae PericarpiuMor Aurantil Fructus Immaturus（C）

2.4.2 線性與范圍 分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積 （A）為縱坐標(biāo) （Y），進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸。實驗結(jié)果表明，各成分在各自進樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 4種黃酮類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of linear equations of four flavones

2.4.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積的RSD分別為1.0%、0.2%、1.4%、0.4% （n=6）。表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24 h進樣10μL，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積積分值RSD分別為0.7%、0.3%、0.3%、0.4%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取批號為121201的樣品，平行制備6份供試品溶液并依法測定。結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含有量分別為1.30、5.48、4.90、7.27 mg/g，RSD值分別為1.3%、1.7%、0.7%、0.8%（n=6）。表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗 精密稱取批號為121201已知各成分含有量的健脾丸6份，每份0.25 g，分別加入一定量的對照品，按照供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，進行回收率測定。結(jié)果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的回收率分別為99.9%、102.5%、99.0%、98.6%，RSD值分別為0.8%、0.8%、1.2%、0.9%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好，具體見表3。

2.4.7 耐用性考察 分別采用3種不同品牌的色譜柱依利特Hypersil ODS、Welch UltimateRXB-C18、COSMOSIL（均為4.6 mm×250 mm，5μm）以及3臺不同品牌高效液相色譜儀島津LC 10-AT、Waters 2695-2996、Angilent1260進行測定，記錄儀器色譜行為的變化。實驗結(jié)果表明，不同條件下所測定的RSD＜3.0%，分離效果理想。因此，健脾丸中4種黃酮類成分定量測定條件較寬，具有較好的耐用性。

表3 4個黃酮類成分的加樣回收率Tab.3 Results of recovery tests for four flavones

2.5 相對校正因子的確定

2.5.1 待測組分相對校正因子的計算 取混合對照品溶液，進樣5、10、15、20、30μL測定，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，分別計算蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷的相對校正因子，結(jié)果見表4。

表4 4種黃酮類成分相對校正因子 （n=2）Tab.4 Relative correction factors（RCF）of four flavones（n=2）

2.5.2 相對校正因子重現(xiàn)性考察 采用島津LC 10-AT，分別考察了3種不同品牌的色譜柱依利特（Hypersil ODS），Welch（Ultimate XB-C18），COSMOSIL（5C12-MS-Ⅱ）；采用依利特Hypersil ODS色譜柱，分別考察了島津LC 10-AT、Waters 2695-2996和Angilent1260液相色譜系統(tǒng)對校正因子的影響，結(jié)果各成分的相對校正因子重現(xiàn)性良好（RSD＜5%）。結(jié)果見表5。

表5 相對校正因子重現(xiàn)性考察 （n=2）Tab.5 Reproducibility of relative correction factors（n=2）

2.5.3 相對校正因子的確定 根據(jù) 《一測多評法建立的技術(shù)指南》［14］，綜合影響校正因子的上述因素，取各次試驗獲得的相對校正因子的平均值，最終確定蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷的相對校正因子分別為1.16、1.01、0.98。

2.6 待測色譜峰的定位 通過計算在不同色譜儀器或不同色譜柱中各待測成分色譜峰與橙皮苷色譜峰的相對保留時間，對各待測成分進行定位。結(jié)果表明相對保留時間的波動較小，其RSD均小于5%，結(jié)果見表6。

表6 各成分的相對保留時間 （n=2）Tab.6 Relative reten tion of each coMponent（n=2）

2.7 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，依法測定10批樣品，采用外標(biāo)法和一測多評法計算健脾丸中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的量，測定結(jié)果見表7。

常規(guī)的外標(biāo)法實測值與一測多評法計算的含有量值相對誤差＜3%，表明兩種方法測得結(jié)果沒有顯著性差異。由此說明一測多評法在健脾丸的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價中應(yīng)用是可行的。

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇 橙皮苷對照品價廉易得、穩(wěn)定，具有藥理活性［15］，故本實驗選用橙皮苷作為內(nèi)參物來實現(xiàn)制劑中4種成分的同時測定。

表7 一測多評與外標(biāo)法測定結(jié)果比較Tab.7 Contents of flavones by QAMSand ESM

3.2 色譜峰的定位 在只使用單個對照品時，本實驗分別采用了各待測成分間的分離度、相對保留時間和時間差3種參數(shù)作為其余3個目標(biāo)色譜峰的定位標(biāo)準(zhǔn)。通過3種不同品牌的高效液相色譜儀和3根不同品牌的色譜柱考察，結(jié)果顯示相對保留時間重現(xiàn)性更好 （RSD＜5%），更能準(zhǔn)確定位目標(biāo)色譜峰。

3.3 檢測波長的選擇 蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳實中主要的黃酮類化合物。本實驗分別對這4種黃酮類對照品進行紫外光譜掃描，最大吸收光譜均在283 nm左右，該波長下樣品各成分峰形較好，基線穩(wěn)定，故選用283 nm作為檢測波長。

3.4 可行性 本實驗初步建立了一測多評法用于健脾丸中4種黃酮類成分的定量測定，與外標(biāo)法測定值無顯著性差異 （RSD＜3%），說明建立的校正因子具有較高的可信度，在僅用1個對照品時可實現(xiàn)多指標(biāo)成分定量測定。

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Quantitative analysis of four flavonoids in Jianpi Pills by QAMS

LIU Yuan1， WEIHui-zhen1， GONG Jian-ping， YU Bing-hui1， JIN Hao-xin2， YANG Shi-lin1，RAO Yi1*
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China；2.The National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine，Nanchang 330006，China）

AIMTo determine the four flavones（narirutin，naringin，hesperidin and neohespridin）in Jianpi Pills（Codonopsis Radix，fried Atractylodismacrocephalae Rhizoma，Citri Reticulatae Pericarpium，fried Aurantii Fructus Immaturus，fried Crataegi Fructus，fried Hordei Fructus Germinatus）using quantitative analysis ofmulticomponents by single marker（hesperidin）（QAMS）.METHODSThe separation ofmethanol-acetate acid extract of Jianpi Pills，purchased froMten manufacturers，was performed on Elite C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），using amixture ofmethanol-5.7%acetic acid（31∶69）asmobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，and detection wavelength was setat283 nm.RESULTSThere was a good relationship between four flavones and relative correction factors repeated on Shimadzu LC 10-AT，Waters2695-2996，and Angilent1260 HPLC systems. The relative error ofmeasured values in internal and external standard method was less than 3%.CONCLUSION

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-0995-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.015

2014-06-24

十二五國家科技支撐計劃 （2011BAI04B06）；2015年版國家藥典委員會課題 中藥提取物新技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用（2014年）

劉 圓（1988—），女，碩士生，研究方向為中藥質(zhì)量控制。E-mail：lyuan9181@126.com

*通信作者：饒 毅（1964—），男，教授，研究方向為中藥質(zhì)量控制。Tel：13807041192，E-mail：raoyi99@126.com