HPLC波長切換法同時測定安神解慮顆粒中4種成分

王瑞娜， 孫耀志， 高 松， 楊 玲， 趙衛(wèi)云， 馮德文

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；2.河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽474500）

［質(zhì)量］

HPLC波長切換法同時測定安神解慮顆粒中4種成分

王瑞娜1， 孫耀志2， 高 松2， 楊 玲1， 趙衛(wèi)云1， 馮德文1

（1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；2.河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽474500）

目的建立HPLC法同時測定安神解慮顆粒中紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸4種有效成分。方法

安神解慮顆粒；HPLC；紫丁香苷；梔子苷；刺五加苷E；迷迭香酸

安神解慮顆粒由刺五加、梔子、夏枯草、柴胡、燈心草、砂仁、珍珠母七味中藥制成，具有疏肝解郁、清熱瀉火安神的功效，用于治療廣泛性焦慮癥。處方中刺五加能補(bǔ)心脾之氣，并益氣以養(yǎng)血，安神益智［1］；梔子能清瀉三焦火邪、瀉心火而除煩，為治熱病心煩、躁擾不寧之要藥［1］；夏枯草苦寒，主入肝經(jīng)，善清肝火以明目［1］。這三味藥與安神解慮顆粒的功效主治緊密相關(guān)，而紫丁香苷、刺五加苷E、梔子苷、迷迭香酸分別是這三味藥的主要有效成分，為了能夠更全面控制藥品的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了同時測定4種成分的HPLC方法，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站，四元梯度泵，VWD檢測器，自動進(jìn)樣器，UP超純水機(jī)；MS105型十萬分之一電子天平；AL104型電子天平；KQ5200型超聲波清洗機(jī)。1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 對照品 紫丁香苷 （批號111574-200603）、梔子苷 （批號0749-200007）、刺五加苷E（批號11713-200502）、 迷 迭 香 酸 （批 號 111871-201203），上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。

1.4 樣品 安神解慮顆粒由河南省宛西制藥股份有限公司研發(fā)部中試生產(chǎn)所得 （批號分別為20140401、20140402、20140403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考 《中國藥典》2010年版一部［2］和相關(guān)文獻(xiàn) ［3-6］，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定色譜條件。Welch Xtimate C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相C相為乙腈、D相為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～25 min，8%C；26～35 min，11%C；36～58 min，14%C；59～88 min，19%C）；檢測波長分別為265 nm（0～25 min），238 nm（25～35 min），220 nm（35～58 min），330 nm（58～88 min）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。在此條件下，紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸與其他組分能達(dá)到較好分離。色譜圖見圖1。

圖1 安神解慮顆粒中紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograMs of syringoside，geniposide，eleutheroside E，rosmarinic acid con tent in Anshen JielüG ranules

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取對照品紫丁香苷5.71 mg、梔子苷28.20 mg、刺五加苷E 9.25 mg、迷迭香酸6.63 mg，分別置于50、10、25、25 mL量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，即得各對照品溶液。精密量取各對照品溶液適量，加75%甲醇溶液混勻定量稀釋成每1 mL含紫丁香苷11.4 μg、梔子苷282.0μg、刺五加苷E 37.0μg、迷迭香酸26.5μg的混合對照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取安神解慮顆粒，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 ML，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（4 000 r/min，20 min），取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方及工藝分別制備不含刺五加、梔子、夏枯草的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下制備成刺五加陰性對照溶液、梔子陰性對照溶液、夏枯草陰性對照溶液。另按處方及工藝制備同時不含刺五加、梔子和夏枯草的陰性樣品，再按 “2.2.2”項(xiàng)下制備成缺刺五加、梔子和夏枯草陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn) 在擬定色譜條件下，所測4種成分與其他組分色譜峰均可基線分離 （R＞1.5），且陰性對照溶液色譜圖中未出現(xiàn)紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E和迷迭香酸的峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其他成分對紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E和迷迭香酸的檢測無干擾。對照品、供試品及陰性對照溶液色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液2、5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X，μg），相應(yīng)的色譜峰峰面積積分值為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸計(jì)算，得線性方程，各對照品進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equation

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液10μL，按照擬定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果4種成分的峰面積的RSD分別為1.5%、0.9%、1.3%、0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 （批號20140401），按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在擬定色譜條件下測定，結(jié)果紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.6%、2.0%、1.3%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按照擬定色譜條件分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.7%、1.6%、1.6%、1.4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量（含紫丁香苷0.473 1 mg/g、梔子苷12.109 3 mg/g、刺五加苷E1.551 6 mg/g、迷迭香酸1.144 8 mg/g）的樣品 （批號20140401）約0.3 g，共6份，精密稱定，置25 ML量瓶中，分別精密加入 “2.2.1”項(xiàng)下配制的混合對照品溶液13.00 mL，再用75%甲醇定容至刻度。按照 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬定色譜條件下測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

由表2可知，紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸的平均回收率均大于95.0%。表明方法回收率良好。

2.10 樣品測定 取3批安神解慮顆粒樣品 （批號20140401、20140402、20140403），研細(xì)，每批 3份，每份約0.6 g，精密稱定質(zhì)量，置具塞錐形瓶中。按 “2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，以 “2.2.1”項(xiàng)下制備的混合對照品為對照品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件對3批樣品 （進(jìn)樣量10μL）進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 （x±s，n=3）Tab.3 Results of content deterMination（x±s，n=3）

3 討論

中藥復(fù)方制劑由多味藥組成，其藥效是通過多種活性物質(zhì)同時發(fā)揮作用而實(shí)現(xiàn)的，故單味藥或單一成分的檢測，難以全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時測定安神解慮顆粒中紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸的含有量，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法簡便可行，為制訂安神解慮顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

3.1 測定成分的選擇 紫丁香苷、刺五加苷E為刺五加的主要成分，刺五加及其苷類提取物，具有明顯的抗疲勞、抗輻射，能改善大腦皮質(zhì)的興奮、抑制過程，提高腦力勞動效能等作用［3-4］。梔子苷為梔子的主要成分，該成分具有保肝、利膽、解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等多種藥理活性［5］。迷迭香酸是夏枯草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎活性和免疫抑制活性、抗抑郁活性、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞等作用［6-7］。這三味藥與安神解慮顆粒的功效主治緊密相關(guān)，故最終選擇對這4種成分進(jìn)行測定。

3.2 樣品溶液的制備 實(shí)驗(yàn)中比較了超聲提取和回流提取兩種方法制備供試品溶液，結(jié)果測得各成分的量無明顯差異，因超聲法具有提取效率高、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，故選用超聲提取法；篩選提取溶劑時考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇、稀乙醇、水，結(jié)果75%甲醇提取效果較好；超聲提取時間的考察，結(jié)果30、40、50、60 min提取效率相當(dāng)。故確定75%甲醇為提取溶劑，超聲提取時間為30 min。

3.3 檢測波長的選擇 參照 《中國藥典》2010年版一部［2］和相關(guān)文獻(xiàn)［3-7］，紫丁香苷在265 nm有最大吸收，梔子苷在238 nm處有最大吸收，刺五加苷E在220 nm處有最大吸收，迷迭香酸330 nm處有最大吸收，故選擇以上4種波長，采用梯度洗脫和階梯掃描的方式，對4種待測成分進(jìn)行檢測。

3.4 流動相的選擇 文獻(xiàn)中多采用乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液等流動相［8-14］。本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比例梯度洗脫，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，分離效果好，峰形好，基線較平穩(wěn)。

［1］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.2版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：91，92，435.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：192，231，263.

［3］姜文紅，劉 靜，仲昭慶，等.HPLC法同時測定刺五加浸膏中3種有效成分的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（6）：1145-1147.

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［5］劉武占，范建偉，高艷紅，等.HPLC同時測定梔子中8個環(huán)烯醚萜苷類成分的含量［J］.中國中藥雜志，2012，37（16）：2417-2421.

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［9］董娟妮，閆高穎，楊 洋，等.HPLC法同時測定樂脈膠囊9種成分［J］.中成藥，2013，35（12）：2644-2649.

［10］于 艷，張立德，田 原，等.HPLC波長切換法同時測定桂枝茯苓丸中4種成分［J］.中成藥，2013，35（11）：2426-2429.

［11］閆高穎，董娟妮，楊 洋，等.HPLC法同時測定心腦康膠囊6種成分［J］.中成藥，2013，35（8）：1672-1675.

［12］張建業(yè)，陳 星，孫云峰.RP-HPLC法同時測定新生化顆粒中羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨［J］.中成藥，2014，36（2）：310-313.

［13］張武崗，張小娟，陳海芳，等.HPLC法同時測定舒胸滴丸中3種成分［J］.中成藥，2014，36（4）：773-775.

［14］章運(yùn)典，周里欣，陳洪英.RP-HPLC法同時測定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷［J］.中成藥，2014，36（8）：1671-1674.

Simultaneous deterMination of four constituents in Anshen JielüGranules by HPLC wavelength switching

WANG Rui-na1， SUN Yao-zhi2， GAO Song2， YANG Ling1， ZHAOWei-yun1， FENG De-wen1
（1.Henan University of Traditional ChineseMedicine，Zhengzhou 450008，China；2.Henan Wanxi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanyang 474500，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for simultaneously determining four constituents，including syringoside，geniposide，eleutheroside E and rosmarinic acid，in Anshen JielüGranules.METHODSThe analysis was carried out on Welch xtimateTMC18column（4.6 mm×250 mm，5μm）.Themobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution in step gradientelutionmode.The flow ratewas1.0mL/min，the column temperature was30℃and the detection wavelengthswere setat220 nm，238 nm，265 nm，and 330 nm，respectively.RESULTSThe experimental data showed a good linearity in the range of 0.022 8-0.285μg（r= 0.999 5）for syringoside，0.564-7.050μg（r=0.999 7）for geniposide，0.074-0.925μg（r=0.999 1）for eleutheroside E，0.053-0.663μg（r=0.999 2）for rosmarinic acid，respectively.The average recoveries were 97.6%，97.4%，97.9%，and 97.3%，respectively.The RSDs were 0.7%，0.8%，0.9%，and 1.1%，respectively.CONCLUSIONThismethod with strong specificity is simple，accurate and reproducible，and it can provide the reference for quality standard for Anshen JielüGranules.

Anshen JielüGranules；HPLC；syringoside；geniposide；eleutheroside E；rosmarinic acid

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-0991-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.014

2014-08-11

王瑞娜（1985—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。Tel：13783659065，E-mail：wrnsunshine@163.com

安神解慮顆粒75%甲醇提取液的分析采用Welch XtimateTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長分別為265 nm（0～25 Min），238 nm（25～35min），220 nm（35～58min）和330 nm（58～88min）。結(jié)果紫丁香苷、梔子苷、刺五加苷E、迷迭香酸的進(jìn)樣量分別在0.022 8～0.285μg（r=0.999 5）、0.564～7.050μg（r=0.999 7）、0.074～0.925μg（r=0.999 1）、0.053～0.663μg（r=0.999 2）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為97.6%、97.4%、97.9%、97.3%，RSD分別為0.7%、0.8%、0.9%、1.1%。結(jié)論本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為安神解慮顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。