橢圓葉花錨總黃酮對脂肪性肝炎模型大鼠的藥理作用研究

顧秀琰， 朱建坤 ， 張 琳

(1. 甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州730050;2. 甘肅中醫(yī)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州730000)

氧自由基關(guān)系到多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，許多疾病的病理變化與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。在肝炎病變過程中，氧自由基是參與其間的一類物質(zhì)，在不同程度和階段的病理過程中可有不同程度和范圍的作用。橢圓葉花錨作為治療肝膽疾病的傳統(tǒng)民族植物藥［1］，對其黃酮類成分抗氧自由基作用的研究，是了解該植物的一項(xiàng)必要途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物與儀器 橢圓葉花錨全草(采自甘肅省甘南藏族自治州，地域海拔3 500 米左右)，由甘肅省中醫(yī)院閔云山主任藥師和甘南林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心杜平研究員共同鑒定。大鼠IgG ELISA、白蛋白ELISA、ALT ELISA 檢測試劑盒(美國USCN 公司);大鼠SOD ELISA、丙二醛ELISA 試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所);恒溫水浴箱、分光光度計(jì)、移液槍(廣州聚能生物科技有限公司)。乙醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SD 大鼠80 只，SPF 級，體質(zhì)量(200 ±20)g (甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK ［甘］2011-0001)。

1.3 橢圓葉花錨黃酮提取流程 橢圓葉花錨全草→干燥→粉碎→過60 目篩→稱定質(zhì)量→75%乙醇浸提→浸提液減壓濃縮成浸膏→干燥→粉碎。

1.4 動物模型(脂肪性肝炎)制備 取正常喂養(yǎng)1 周后的大鼠80 只，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、高劑量組、低劑量組，每組20 只，均給以普通飼料，自由飲水。其中，模型組大鼠附加高能量合劑，用合劑加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL 的混濁液，按1 g 高能合劑/100 g 大鼠體質(zhì)量的量，每天灌胃1 次，連續(xù)30 d。結(jié)果，觀察到大鼠行動遲緩、毛色晦暗、肝臟有不同程度的腫大或右肋下觸痛敏感、進(jìn)食量減少等體貌特征，而且肝臟組織HE染色發(fā)現(xiàn)，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，少許細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞壞死，說明造模成功［2］(高能量合劑的組成為豬油15 g、植物油15 g、膽固醇7.5 g、蔗糖15 g、膽鹽1 g、奶粉8 g、復(fù)合維生素0.5 g、吐溫8.5 mL、丙二醇5 mL，加蒸餾水至100 mL［3］)。

1.5 給藥方法 造模成功后7 d 開始給藥，其中高、低劑量組是給藥組，分別以5、1 g/kg 的量加入橢圓葉花錨黃酮(加入方法為稱定每組大鼠的總體質(zhì)量，分別以5、1 g/kg的比例稱取橢圓葉花錨黃酮，混入粉碎的飼料中，壓制烘干)，連續(xù)給藥15 d，給藥結(jié)束后按造模前正常的飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物處理 給藥結(jié)束，正常飼養(yǎng)7 d 后，麻醉大鼠，股動脈采血(不加抗凝劑)約5 mL。然后，斷頸處死大鼠，剖腹摘取肝臟，置于4%福爾馬林溶液中固定。

1.7 標(biāo)本處理

1.7.1 肝臟切片 取固定好的肝臟組織，放入脫水機(jī)中進(jìn)行脫水(95%乙醇階段加上E 染色操作)，再通過透明、透蠟、包埋、切片、貼片、烘干、脫蠟、復(fù)水以及H 染色后，得到肝臟組織細(xì)胞染色切片。然后，通過顯微鏡觀察、對比、分析肝臟組織學(xué)變化。

1.7.2 血清檢測 利用酶聯(lián)免疫法分別對SOD、MDA、血清白蛋白(ALB)以及ALT 這四種生化物質(zhì)進(jìn)行定量檢測，將采得的血液置于試管中，待其凝固后，分離血清。然后，準(zhǔn)備酶聯(lián)反應(yīng)孔板，設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔以及加標(biāo)孔，分別加樣，按照溫育→配液→洗滌→加酶→溫育→洗滌→顯色→終止的步驟，應(yīng)用SOD 試劑得到測定液。在待測樣品終止15 min 內(nèi)進(jìn)行測定，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長下依次測量各孔的吸光度，分別得到SOD 和MDA 的OD值。由于光度值直接反映了生化物質(zhì)含有量的變化，因此本實(shí)驗(yàn)直接用它進(jìn)行結(jié)果比較與分析，不進(jìn)行含有量值的轉(zhuǎn)換。

1.8 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以±s 表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用方差分析，組間差異的兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 橢圓葉花錨黃酮對脂肪性肝炎模型大鼠肝細(xì)胞的影響在肝臟切片病檢時(shí)觀察到，模型對照組大多(15 個切片，占75%)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松，呈網(wǎng)狀半透明，具備胞漿疏松化特征，匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞的浸潤，胞漿內(nèi)多見脂滴性空泡，提示肝細(xì)胞脂肪性變化特征。另外，低劑量治療組病理切片觀察結(jié)果與模型對照組細(xì)胞的組織特點(diǎn)接近，見圖1;高劑量治療組大多(14 個切片，占70%)干細(xì)胞分布均勻，胞漿疏松化肝細(xì)胞較少，膽管與匯管區(qū)受壓程度減輕，炎癥細(xì)胞少見或沒有，見圖2。

圖1 模型對照組肝臟切片(20 ×40)

圖2 高劑量藥物組肝臟切片(20 ×20)

2.2 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影響 與空白組比較，模型組ALB 水平降低，ALT 水平升高，提示模型大鼠肝細(xì)胞受損，血清蛋白合成減少，細(xì)胞受損后轉(zhuǎn)氨酶釋入血液的量顯著增加(P ＜0.05);與模型組比較，各劑量組ALB 水平升高，ALT 水平降低，提示肝細(xì)胞受損程度明顯緩解(P ＜0.05)。另外，低、高劑量組間ALB 和ALT 水平的差異不顯著(P ＞0.05)，但反映出含有量變化趨勢，高劑量黃酮與低劑量相比，在保護(hù)肝細(xì)胞方面呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的正比例關(guān)系，見表1。

表1 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影響(±s)

表1 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清ALB 和ALT 水平的影響(±s)

注:與模型組比較，* P ＜0.05;與空白組比較，△P ＜0.01

組別 例數(shù)ALB/(mg·L -1)ALT/(U·L -1)20 370.6 ±23.5 215.2 ±21.4模型組 20 180.4 ±16.3 615.2 ±34.2△橢圓葉花錨黃酮低劑量組 20 278.4 ±41.2 490.4 ±12.6*橢圓葉花錨黃酮高劑量組空白組20 321.1 ±14.5 410.3 ±32.2

2.3 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清SOD 與MDA 水平的影響 與空白組比較，模型組SOD 水平減少、MDA 水平升高，表明在肝病過程中，過氧化反應(yīng)加速，肝細(xì)胞處于受損的變化狀態(tài)，清除氧自由基的酶系能力顯著降低(P ＜0.05);與模型組比較，劑量組SOD 水平明顯升高(P ＜0.05)，但低、高劑量組間SOD 水平的差異不顯著(P ＞0.05);與模型組比較，低劑量組MDA 水平降低，但兩組間差異不顯著(P ＞0.05)，而低、高劑量組間MDA 水平的差異顯著(P ＜0.05)，見表2。

表2 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清SOD 與MDA 水平的影響(±s)

表2 橢圓葉花錨黃酮對SD 大鼠血清SOD 與MDA 水平的影響(±s)

注:與模型組比較，* P ＜0.05;與空白組比較，△P ＜0.01

組別 動物數(shù)SOD/(U·g -1)MDA/(mol·g -1)20 252.82 ±32.42 174.71 ±31.11模型組 20 128.13 ±30.35 403.10 ±33.76△橢圓葉花錨黃酮低劑量組 20 290.85 ±43.26 350.56 ±67.49*橢圓葉花錨黃酮高劑量組空白組20 312.23 ±29.12 210.79 ±53.13

3 討論

肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致肝細(xì)胞損害和壞死，病理過程中免疫系統(tǒng)的參與是主要的病理環(huán)節(jié)。有研究證實(shí)，在肝病變過程中，肝臟局部會聚集大量的Treg 細(xì)胞，是外周Treg 細(xì)胞對病變組織的趨化［4］，表明在肝病過程中免疫機(jī)制是增強(qiáng)的。此外還有非免疫因素，如微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素(ETM)和氨基酸失衡等，氧自由基(OFR)與病毒性肝炎關(guān)系之研究正日益引起重視并逐步深入［5］。OFR 對組織的損害，除了對肝細(xì)胞直接毒性外，它還參與免疫功能紊亂、肝微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、鈣穩(wěn)定失衡等一系列病毒性肝炎的病理生理過程，在整個病理過程中都可能對肝細(xì)胞造成損害。氧自由基過多對機(jī)體的危害表現(xiàn)在使許多生物分子，如核酸、蛋白、膜多聚不飽和脂肪酸(PUFA)等產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，生物大分子出現(xiàn)交鏈或斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的破壞。PUFA 的過氧化將直接影響膜結(jié)構(gòu)，使膜孔隙擴(kuò)大、通透性增加;細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體膜、溶酶體膜等生物膜系統(tǒng)的液體鑲嵌模式發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞廣泛損害。另外，自由基和過氧化脂質(zhì)(LPO)在肝炎的肝細(xì)胞損害中也起到了重要作用。

SOD 能催化·O-產(chǎn)生歧化反應(yīng)，是體內(nèi)·O-的天然清除酶，在清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化過程中起著主要作用［6］。肝炎患者抗氧化酶系統(tǒng)中的一些分子可能受到損害，從而使清除自由基的能力降低，增加的氧自由基通過破壞生物大分子，導(dǎo)致了肝細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)的改變以及肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，促進(jìn)了免疫反應(yīng)及炎癥的發(fā)展，炎癥的發(fā)展使自由基的產(chǎn)生進(jìn)一步增加，血清LPO 水平升高，而自由基增加又可加重肝細(xì)胞的病變，從而形成惡性循環(huán)［7］。對抗氧自由基是藥物治療肝炎機(jī)制中的一個可能環(huán)節(jié)［8］，通過藥物影響氧自由基變化的實(shí)驗(yàn)，可以證明橢圓葉花錨治療肝炎的可能途徑之一是抗氧自由基路徑。另一方面，黃酮是廣泛分布的一類物質(zhì)，生物類黃酮能夠有效清除體內(nèi)的自由基，具有消炎、抗菌、抗病毒、保肝、護(hù)肝等作用，黃酮類物質(zhì)抗氧自由基作用是確定的。該類化合物的結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)，此外，它還常與糖結(jié)合成苷，黃酮苷一般易溶于水，而如白藜蘆醇等化合物的水溶性很低，故必須與相關(guān)蛋白結(jié)合后才能在血清中保持較高的濃度［9］。花錨全草含有三萜類、黃酮類、酮類等近20 種化學(xué)成分，其中水溶性成分花錨苷和去甲氧基花錨苷為抗肝炎的主要有效成分［10］。橢圓葉花錨中含有齊墩果酸，已有大量研究證實(shí)，它具有清熱、消炎、抑菌、保肝、護(hù)肝、增加白細(xì)胞、降低轉(zhuǎn)氨酶等作用［11］。而且，黃酮苷元類成分是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一［12］，其中呫噸酮苷對CCl4所引起的實(shí)驗(yàn)性肝損傷有促進(jìn)恢復(fù)的作用，能促進(jìn)肝細(xì)胞再生，增加肝細(xì)胞內(nèi)糖元與核糖核酸［13］?；ㄥ^的酮單體成分和提取部位均具有保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病原微生物等作用［14］。MDA是氧自由基使細(xì)胞膜中的PUFA 發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，通過測定血清中MDA 水平，可間接反應(yīng)氧自由基的活性，與SOD 共同作為反映人體自由基代謝的一對指標(biāo)，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，也可作為肝細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)，與病情活動或疾病進(jìn)程相關(guān)［15］。中藥清除超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等產(chǎn)物，使得SOD、和CAT 活性增加，也減少了氧自由基對組織和細(xì)胞的攻擊，使MDA 水平下降［16］。

基于以上認(rèn)識，我們開展了對橢圓葉花錨黃酮藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究，在測定血清SOD 和酯質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平變化的同時(shí)，對大鼠肝臟進(jìn)行了病理切片觀察，從選用實(shí)驗(yàn)指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)中的變化關(guān)系上，驗(yàn)證橢圓葉花錨治療肝炎的可能途徑。從理論上講，SOD 廣泛存在于機(jī)體，其活力的體現(xiàn)一方面是其水平高低差異直接的影響，而另一方面，是在一定水平上不同強(qiáng)度(水平)的作用力，這與機(jī)體一定階段的生化狀態(tài)條件有關(guān)，由于其廣泛存在，故是主要的機(jī)制，也能體現(xiàn)中醫(yī)藥作用的本質(zhì)在于改善機(jī)體生化狀態(tài)而不單純是物質(zhì)在量上的累加。目前涉及SOD 的藥物是其自身制劑，而提高其水平的大多是中醫(yī)藥研究，或者是與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)度不高的藥物。所以，實(shí)驗(yàn)中沒有設(shè)立藥物對照組，而是通過自身對照來證明藥物實(shí)際藥理效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，橢圓葉花錨總黃酮能降低實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笱錗DA 水平，同時(shí)提高SOD 水平，表明黃酮類成分在治療肝病的過程中，對抗氧自由基酶系統(tǒng)(SOD 是其中主要的一種酶)起到了輔助增強(qiáng)的作用，判斷依據(jù)是SOD 水平的升高與MDA 水平的下降。肝臟病理檢查提示，橢圓葉花錨總黃酮可以改善肝細(xì)胞受損的狀態(tài)，這種作用應(yīng)該歸結(jié)于對酶類分子合成與衰減的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)分子代謝的途徑可以歸類于基因靶位的作用，但具體的分子機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)中無法得到明確的認(rèn)識。

另外，本實(shí)驗(yàn)只是在總黃酮和血清物質(zhì)含有量測定的水平上進(jìn)行，是對藥物進(jìn)行研究的初步實(shí)驗(yàn)層次，而對藥物透徹的把握，需要深入到分子層面，從具體分子調(diào)控的位點(diǎn)與途徑去分析藥物的作用機(jī)理。而且，對藥物還應(yīng)該進(jìn)一步提純，越是純化的藥物成分，越能反映藥理作用的可靠性。調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生和作用的關(guān)鍵點(diǎn)便能控制氧自由基損傷肝細(xì)胞的病理過程，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生、應(yīng)用細(xì)胞因子增強(qiáng)或抑制分子應(yīng)答，可能成為治療肝病的一個途徑。今后，對橢圓葉花錨的研究應(yīng)該以此為標(biāo)準(zhǔn)，純化藥物成分并確定實(shí)驗(yàn)分子水平的理論路徑，開展進(jìn)一步深入的研究。

［1］ 劉黃剛，張鐵軍，王麗莉，橢圓葉花錨的利膽有效成分分離與鑒定［J］. 藥物評價(jià)研究，2011，6(34):448-449.

［2］ 倪鴻昌，李 俊，金 涌，等. 大鼠實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝炎模型的研究［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(3):281-284.

［3］ 孫林林，石 軍，郝菁華，等. 高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化模型的建立［J］. 臨床肝膽病雜志，2011，27(3):254-257.

［4］ 趙娜娜，趙婷婷，刑 艷，等. 肝細(xì)胞性肝癌腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表型分析和功能探討［J］. 免疫學(xué)雜志，2013，29(2):115-120.

［5］ 王炳林. 氧自由基與病毒性肝炎［J］. 華人消化雜志，1998，6(2):99-100.

［6］ 王慶利. 超氧化物歧化酶催化反應(yīng)機(jī)理的研究［D］. 濟(jì)南:山東師范大學(xué)，2009.

［7］ 張曉剛，甘 華. 自由基與病毒性肝炎［J］. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，14(1):75-77.

［8］ 馮 霞. 綜合療法加抗氧自由基治療乙型肝炎27 例護(hù)理體會［J］. 山東醫(yī)藥，2003，43(14):63-64.

［9］ 黃笛鳴，單汗國，謝文彪，白藜蘆醇對人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(9):1071-1074.

［10］ 孫洪發(fā)，胡伯林，丁經(jīng)業(yè)，等. 花錨的三種新酮甙［J］. 植物學(xué)報(bào):英文版，1987，29(4):422-428.

［11］ 田麗婷，馬 龍，堵年生. 齊墩果酸的藥理作用研究概況［J］. 中國中藥雜志，2002 ，27(12):884-887.

［12］ 高 潔，王素娟，徐瑞明，等. 以體內(nèi)吸收分布特點(diǎn)指導(dǎo)花錨成分的研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(3):198-203.

［13］ 張經(jīng)明. 花錨及其酮甙抗肝損傷和毒性的研究［J］. 中草藥，1984，15(10):34.

［14］ 古 銳，鐘國躍，張 藝，等. 藏藥橢圓葉花錨的研究進(jìn)展［J］. 中藥新藥與臨床藥理，2009，20(4):397-401.

［15］ 張文中，張 彤，賀麗香，等. 乙型肝炎患者血清氧自由基變化與病變程度及病毒含量的關(guān)系［J］. 天津醫(yī)藥，2002，30(7):390-391.

［16］ 王錦錦，李重陽，俞詩源，等. 中藥小復(fù)方(液)對麻黃素致?lián)p傷中腎SOD、CAT 活性及Bax 蛋白與TGF-β1 表達(dá)的影響［J］. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35 (7):1-7.