雞血藤總黃酮對大鼠急性心肌缺血的保護作用

李 麗， 王林萍

(淄博市中心醫(yī)院干?？疲綎| 淄博255036)

雞血藤CauLis spatholobi 為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn 的干燥藤莖，是一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，本草論著中記載，它具有去瘀血、生新血之功效，為“血分之圣藥”，主要含有黃酮類、酚類和三萜類等化合物［1］。雞血藤總黃酮為雞血藤的醇提物，具有抗腫瘤［2］活性，并且對腦缺血［3］和肝損傷有保護作用［4］。目前，關(guān)于雞血藤總黃酮對心肌缺血的研究尚無報道。本實驗擬采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法，用于觀察其對大鼠急性心肌缺血的保護作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑 雞血藤總黃酮(濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心)，提取方法為稱取雞血藤適量，烘干，粉碎，95%乙醇超聲提取2.5 h，抽濾，重復(fù)2 次，合并濾液，減壓回收乙醇，得到雞血藤提取物，以蘆丁為對照品，測得其中總黃酮的含有量≥80%;單硝酸異山梨酯片(齊魯制藥有限公司);烏拉坦(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗儀器 FX-2111 單道心電圖機(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司);DL-4000B 冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);AUTOLAB 全自動生化分析儀 (意大利AMS公司)。

1.3 實驗動物 清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量200 ～250 g (北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格號SYXK［魯］20060009)。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及模型的復(fù)制 參考文獻［5］，取心電圖檢測合格的大鼠60 只，隨即分為假手術(shù)組、模型組、單硝酸異山梨酯(10 mg/kg)組、雞血藤總黃酮(20、40 和80 mg/kg)劑量組。其中，給藥組每天灌胃給藥(10 mL/kg)1 次，連續(xù)7 d，而假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積的去離子水。于末次給藥后1 h，20% 烏拉坦(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰位固定于手術(shù)臺上，記錄正常標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，沿胸骨左緣3 ～4 肋間開胸，暴露心臟，于距左心耳下緣2 mm 水平處，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支(假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎)，結(jié)扎后即刻擠出胸腔氣體，關(guān)閉胸腔，迅速縫合胸壁。

2.2 心電圖ST 段的測定 于冠脈結(jié)扎前所記錄的心電圖作為缺血前值(基礎(chǔ)值)，結(jié)扎后于30、60、90、120 和180 min 分別記錄心電圖，測量并計算ST 段抬高幅度。

2.3 心肌組織中SOD 活性及MDA 水平的測定 實驗結(jié)束后，分離心肌組織，以4 ℃生理鹽水沖洗表面的血液殘留，冰浴下制成10%組織勻漿液，離心，取上清液，按照考馬斯亮蘭試劑盒操作說明測定蛋白、心肌組織中SOD 活性及MDA 的水平。

2.4 血清中GOT、CK 和LDH 水平的測定 于術(shù)后180 min 腹主動脈取血，離心取血清，測定GOT、CK 和LDH的水平。

2.5 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取左心室缺血區(qū)心肌組織，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察［6］。

3 結(jié)果

3.1 雞血藤總黃酮對心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響 模型組ST 段抬高幅度顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，表明大鼠急性心肌缺血模型復(fù)制成功。與模型組相比，雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組ST 段抬高幅度顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，而20 mg/kg 劑量組不明顯(P ＞0.05)。單硝酸異山梨酯組ST 段抬高幅度與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表1。

表1 雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎大鼠ST 段的影響(±s)

表1 雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎大鼠ST 段的影響(±s)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) 基礎(chǔ)值/mV 30 min/mV 60 min/mV 90 min /mV 120 min/mV 180 min/mV假手術(shù)組 — 0.06 ±0.02 0.07 ±0.02 0.08 ±0.02 0.06 ±0.02 0.07 ±0.02 0.06 ±0.02模型組 — 0.07 ±0.02 0.46 ±0.09＊＊ 0.45 ±0.07＊＊ 0.45 ±0.06＊＊ 0.39 ±0.07＊＊ 0.37 ±0.07＊＊單硝酸異山梨酯 10 0.06 ±0.01 0.32 ±0.09△△ 0.34 ±0.06△ 0.35 ±0.05△ 0.33 ±0.08△ 0.30 ±0.05△雞血藤總黃酮 80 0.06 ±0.02 0.34 ±0.06△ 0.32 ±0.08△△ 0.32 ±0.07△△ 0.32 ±0.05△△ 0.29 ±0.06△△雞血藤總黃酮 40 0.08 ±0.02 0.35 ±0.08△ 0.35 ±0.07△ 0.36 ±0.06△ 0.34 ±0.06△ 0.31 ±0.06△雞血藤總黃酮 20 0.07 ±0.01 0.43 ±0.09 0.44 ±0.09 0.43 ±0.07 0.42 ±0.07 0.36 ±0.08

3.2 雞血藤總黃酮對心肌組織中SOD 活性和MDA 水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD 活性顯著降低(P ＜0.01)，而MDA 水平顯著升高(P ＜0.01)，說明急性心肌缺血導(dǎo)致組織的抗氧化能力顯著降低。雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組大鼠心肌組織中SOD 活性顯著高于模型組，而MDA 水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);與模型組相比，單硝酸異山梨酯組SOD 亦升高，并降低MDA，具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＜0.01)，見表2。

3.3 雞血藤總黃酮對血清GOT、CK 和LDH 水平的影響模型組血清LDH、CK 和GOT 水平顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，表明大鼠急性心肌缺血模型復(fù)制成功。與模型組相比，雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組三者水平顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，而20 mg/kg 劑量組不明顯(P ＞0.05)。單硝酸異山梨酯組三者水平較模型組顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表3。

表2 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠心肌中SOD 活性和MDA 水平的影響(±s，n=10)

表2 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠心肌中SOD 活性和MDA 水平的影響(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)SOD/(U·mg protein -1)MDA/(mmol·mg protein -1)4.83 ±1.72 7.35 ±1.41模型組 — 1.75 ±0.68＊＊ 13.42 ±1.79＊＊單硝酸異山梨酯 10 3.16 ±0.83△△ 10.63 ±2.32△△雞血藤總黃酮 80 3.34 ±0.87△△ 10.96 ±1.82△△雞血藤總黃酮 40 2.79 ±0.74△ 11.26 ±1.74△雞血藤總黃酮假手術(shù)組 —20 2.37 ±0.65 12.03 ±1.97

表3 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠血清GOT、CK 和LDH 的影響(±s，n=10)

表3 雞血藤總黃酮對冠脈結(jié)扎大鼠血清GOT、CK 和LDH 的影響(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) GOT/(U·L -1) CK/(U·L -1) LDH/(U·mL -1)58.75 ±6.87 713.84 ±153.26 434.15 ±108.26模型組 — 438.47 ±97.26＊＊ 3 984.27 ±1 143.55＊＊ 3 548.65 ±1 084.42＊＊單硝酸異山梨酯 10 274.47 ±90.51△△ 2 537.14 ±837.46△△ 1 792.13 ±607.36△△雞血藤總黃酮 80 254.62 ±73.24△△ 2 215.47 ±613.22△△ 1 759.37 ±528.82△△雞血藤總黃酮 40 291.47 ±71.83△ 2 791.36 ±988.76△ 2 107.53 ±827.26△雞血藤總黃酮 20 351.34 ±112.43 3 369.07 ±972.43 2 851.18 ±91假手術(shù)組 —4.22

3.4 雞血藤總黃酮對心肌組織病理學(xué)的影響 光學(xué)顯微鏡下可見，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤;模型組心肌纖維腫脹，排列紊亂，心肌間質(zhì)中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，甚至可見局灶性壞死區(qū);雞血藤總黃酮40 和80 mg/kg 劑量組心肌組織細(xì)胞核大小較均勻，心肌纖維排列較整齊，呈輕度腫脹，偶見炎癥細(xì)胞浸潤;單硝酸異山梨酯組HE 病理表現(xiàn)與雞血藤總黃酮40 mg/kg劑量組相似，見圖1。

4 討論

冠心病(缺血性心臟病)屬于中醫(yī)“胸痹”范疇，主要病機是氣滯、血瘀、寒凝、痰阻導(dǎo)致胸陽不振，心脈痹阻。誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血的方法很多，其中結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支與冠心病人嚴(yán)重心肌缺血及心肌梗死時的血流動力學(xué)和心肌代謝等指標(biāo)的改變有一定相似之處，而且梗死發(fā)生快，缺血范圍較固定，模型可靠。雞血藤是一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，而黃酮類是其主要成分之一，目前尚未報道雞血藤總黃酮對心肌缺血保護作用的相關(guān)研究。因此，本實驗采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法復(fù)制心肌缺血模型，從心肌中SOD 和MDA、血清心肌酶(GOT、CK 和LDH)水平及組織形態(tài)等方面來探討雞血藤總黃酮對大鼠急性心肌梗死的保護作用及機制。實驗結(jié)果表明，它能顯著抑制結(jié)扎冠狀動脈前降支致心肌缺血大鼠心電圖ST 段抬高、升高心肌SOD 活性、降低MDA 水平和心肌酶活性，而且還可顯著減輕心肌組織的病理改變。

圖1 雞血藤總黃酮對心肌病理組織學(xué)的影響(HE，×200)

心電圖ST 段的改變是心肌缺血最早期出現(xiàn)的、最敏感確切的指標(biāo)之一，是反映心肌缺血性損傷范圍和程度的可靠指標(biāo)［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)，雞血藤總黃酮可劑量依賴性地抑制冠脈結(jié)扎所致大鼠心電圖ST 段的抬高，表明它對冠脈結(jié)扎所致大鼠心肌缺血具有一定的保護作用。

大量氧自由基的形成是心肌缺血發(fā)生的主要機制之一［8］，而氧自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在機體的新陳代謝過程中起著重要作用。在正常情況下，這兩者處于協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡狀態(tài)，維持著體內(nèi)許多生理生化和免疫反應(yīng)，一旦這種平衡狀態(tài)被打破，機體就會處于一種氧化應(yīng)激狀態(tài)，在心肌缺血損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用。當(dāng)心肌缺血時，氧自由基大量產(chǎn)生，與細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。同時，由于要清除體內(nèi)過量的氧自由基，從而導(dǎo)致組織的抗氧化能力下降。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 對細(xì)胞膜有很強的破壞作用，使膜流動性和通透性發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)外離子分布異常，進而抑制心肌功能，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞從可逆性損傷發(fā)展為細(xì)胞死亡。心肌酶GOT、CK 和LDH 廣泛存在于心肌組織，當(dāng)心肌缺血時，心肌細(xì)胞受到損傷，大量心肌酶釋放入血，故測定血清中心肌酶活性可反映心肌細(xì)胞的損傷程度［9］。SOD 是內(nèi)源性氧自由基清除劑，而MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，兩者均是反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標(biāo)。測定MDA 水平和SOD 活性能反映出心肌遭氧自由基攻擊的程度［10-11］和體內(nèi)清除氧自由基的能力［12-13］。實驗結(jié)果表明，雞血藤總黃酮中、高劑量組可明顯抑制冠脈結(jié)扎致大鼠心肌組織SOD 活性的降低和MDA水平的升高，顯著抑制心肌酶(GOT、CK 和LDH)活性的增加，提示其可能通過提高內(nèi)源性抗氧化酶SOD 活性，清除氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕對心肌細(xì)胞的損傷，從而起到保護心肌損傷的作用。

另外，心臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明，雞血藤總黃酮能顯著減輕心肌纖維腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤以及局灶性壞死的程度。

綜上所述，雞血藤總黃酮對左冠狀動脈前降支結(jié)扎所致大鼠心肌缺血損傷具有一定保護作用，其機制可能與清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

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