夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)移植性人白血病模型小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

羅發(fā)軍， 趙世元 ， 鐘振國(guó)

(1. 廣西崇左市中醫(yī)壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 崇左532200;2. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，廣西 南寧530001;3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001)

夜香樹Cestrum nocturnum Linn 為茄科夜香樹屬植物，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，夜香樹葉和嫩枝的正丁醇和乙醇提取物體內(nèi)對(duì)人體幾種腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用，作者曾報(bào)道夜香樹甾體皂苷體外對(duì)K562 細(xì)胞增殖抑制作用［1-4］。本研究擬以人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562 建立的白血病SCID 模型小鼠，觀察夜香樹提取物nocturnoside A 體內(nèi)對(duì)白血病SCID 模型小鼠的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 夜香樹提取物nocturnoside A 的提?。?］取干燥的夜香樹葉和嫩枝2.3 kg，經(jīng)95%乙醇浸泡24 h，過濾，濾液加熱回流提取，減壓濃縮得乙醇浸膏，乙醇浸膏用硅膠拌勻后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。取正丁醇部位浸膏，用硅膠拌勻后，采用硅膠柱色譜法分離，先用三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，經(jīng)薄層檢識(shí)后將相同的溶液合并，發(fā)現(xiàn)在三氯甲烷-甲醇比例為20 ∶1 時(shí)有結(jié)晶析出，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，三氯甲烷甲醇混合物液洗脫，甲醇重結(jié)晶，得到一種不定型的結(jié)晶物。該化合物純度為99.1%。該化合物單體含C、H、O 等3 種元素;經(jīng)鑒定為nocturnoside A［6］。實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水溶解后加到所需的質(zhì)量濃度，置HV-50 自動(dòng)高壓滅菌器120 ℃、30 min，冷卻后將其置于超凈工作臺(tái)中(事先以紫外線燈消毒30 min)分裝。藥品配好后置4 ～8 ℃冰箱保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SCID 小鼠，SPF 級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK (京)2006-009。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)GIBGO 公司產(chǎn)品);注射液環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)111104);小鼠抗人CD13 單克隆抗體、DAB 試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品);FISH 雙色BCR/ABL 融合基因DNA 探針(Cytocell 公司);甲酰胺(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);NP-40 (瑞士羅氏試劑公司)。

1.3 儀器 381-CO2培養(yǎng)箱 (Thermo Forma，美國(guó));TE2000-U-倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本);CK40-倒置顯微鏡(Olympus，日本);SYSMEX-XT2000i (血球計(jì)數(shù)儀，日本產(chǎn));Beckman Epicsxl (流式細(xì)胞儀，美國(guó)產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人慢性粒白血病細(xì)胞株K562 購自上海中科院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，并加慶大霉素(800 U/mL)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 白血病模型小鼠的建立［7］SCID 小鼠，雌雄兼有，8 ～10 周齡，體質(zhì)量18 ～22 g。移植細(xì)胞之前連續(xù)2 d 腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)2 mg/只，于第3 天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞以5 × 106個(gè)/鼠的量尾靜脈注射移植到小鼠體內(nèi)。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥方法 接種K562 細(xì)胞7 d 之后進(jìn)行分組給藥，分為5 組，分別為夜香樹提取物nocturnoside A 高、中、低劑量組、陽性環(huán)磷酰胺組和模型組，每組8只。nocturnoside A 高、中、低劑量分別為6、4、2 mg/kg。nocturnoside A 組隔天腹腔注射夜香樹提取物nocturnoside A;陽性藥環(huán)磷酰胺組隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg;模型組隔天腹腔注射等量的氯化鈉注射液，連續(xù)用藥15次。30 d 后處死小鼠，取其肝、肺及脾臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.4 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 對(duì)照組和夜香樹提取物nocturnoside A 組接種細(xì)胞前后以及給藥后每周進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，進(jìn)行外周血細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.5 病理學(xué)檢查 取各組小鼠的肝、脾、肺以10%甲醛固定48 h，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水，再用石蠟包埋切片，封片后HE 染色進(jìn)行光鏡觀察。

1.2.6 CD13 陽性表達(dá)率檢測(cè) 取各組小鼠的肝、脾和肺組織制成細(xì)胞懸浮液，按試劑盒的說明進(jìn)行操作，處理樣品立即進(jìn)行溶式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)其CD13 陽性表達(dá)率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)脾臟組織中pAKS473、pAKT308、AKT 及PTEN 蛋白的表達(dá) 稱取100 mg SCID 小鼠的脾臟組織，勻漿后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，先在恒壓100 V 電泳20 min 隨后150 V 電泳60 min，然后在250 mA 的條件下電轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗兔抗人pAKS473、pAKT308、AKT 及PTEN 單克隆抗體各10 mL (β-actin 的稀釋度為1 ∶5000，PI3K、AKT 及PTEN 的稀釋度均為1 ∶1 000)4 ℃過夜;然后加入相應(yīng)的生物素化Ⅱ抗(均為1 ∶2 000 稀釋)室溫2 h，最后再加入ABC 復(fù)合物室溫30 min，加入DAB 顯色液。以β-actin 為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3 次。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析組間差異，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，結(jié)果均采用±s 的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 正常SCID 小鼠的白細(xì)胞(WBC)總數(shù)為(5.03 ±0.52) ×109個(gè)/L，接種K562 細(xì)胞7 d 后WBC 總數(shù)為(6.41 ±2.22) ×109個(gè)/L，可見，接種K562 細(xì)胞SCID 小鼠外周血象早期變化不大;接種2周后小鼠外周血象WBC 總數(shù)開始升高，血涂片經(jīng)瑞士染色后在油鏡下可見有白血病細(xì)胞，病程后期外周血白血病細(xì)胞超過10%，偶見有原始粒細(xì)胞;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療SCID 白血病模型小鼠1 周后，小鼠外周血白細(xì)胞有所減少，但不明顯，治療2 周后，外周血白細(xì)胞總數(shù)、有核細(xì)胞數(shù)比模型組明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ﹤0.05)。見表1。

表1 夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)白血病模型小鼠外周血象變化(±s，n=8)

表1 夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)白血病模型小鼠外周血象變化(±s，n=8)

注:與模型組比較，*P ﹤0.05，＊＊P ﹤0.01

組別 給藥時(shí)間/周白細(xì)胞/(109·L -1)淋巴細(xì)胞/%中性粒細(xì)胞/% K562 細(xì)胞/%接種K562 細(xì)胞后 1 6.41 ±2.22 79.26 ±12.37 3.55 ±2.67 0模型組 2 11.35 ±3.99 80.56 ±11.18 3.51 ±3.40 5.3 ±1.2模型組 3 15.84 ±5.64 89.25 ±3.03 1.12 ±0.57 13.5 ±4.3 nocturnoside A 高劑量組 2 8.22 ±3.22* 73.35 ±7.57 7.07 ±4.08 4.2 ±1.5 nocturnoside A 高劑量組 3 4.89 ±2.37＊＊ 78.37 ±12.21 4.50 ±2.81 6.8 ±2.2＊＊nocturnoside A 中劑量組 2 8.52 ±2.62* 72.35 ±8.12 8.08 ±4.01 5.4 ±1.3 nocturnoside A 中劑量組 3 5.76 ±2.65＊＊ 77.37 ±12.21 5.70 ±2.58 7.4 ±3.5＊＊nocturnoside A 低劑量組 2 9.52 ±3.43* 74.35 ±8.56 8.17 ±4.42 5.2 ±2.4 nocturnoside A 低劑量組 3 6.89 ±2.12＊＊ 77.37 ±12.21 5.10 ±2.56 8.1 ±2.3＊＊陽性對(duì)照組 2 7.38 ±2.25* 71.80 ±8.83 7.30 ±2.25 3.9 ±1.5陽性對(duì)照組 3 3.80 ±1.89＊＊ 72.81 ±15.13 7.82 ±4.95 5.2 ±2.1＊＊

2.2 病理學(xué)檢查 SCID 小鼠白血病模型小鼠，晚期可見腹水，病變主要累及肺、腎、脾、肝;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療小鼠白血病模型后病變明顯減輕。脾組織切片HE 染色，模型組鏡下看見白髓萎縮或破壞程度++ +;脾血竇擴(kuò)張+ +;含鐵血黃素沉積+ + +;白髓和紅髓內(nèi)巨噬細(xì)胞增多程度+ + +;脾小梁破壞程度+ + +;用夜香樹提取物nocturnoside A 治療白血病模型后，小鼠白髓萎縮或破壞程度+ +;脾血竇擴(kuò)張+;含鐵血黃素沉積+ + +;白髓和紅髓內(nèi)巨噬細(xì)胞增多程度+ +;脾小梁破壞程度+ +。見圖1。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)模型組、nocturnoside A 組SCID 小鼠骨髓細(xì)胞CD13 表達(dá) 模型組SCID 小鼠骨髓CD13 的陽性率為(8.35 ±2.35)%，夜香樹提取物nocturnoside A 高、中、低組SCID 小鼠骨髓CD13 的陽性率為(3.62 ±1.56)%、(4.86 ±1.75)%、(5.89 ±1.82)%，與模型組比較有非常顯著差異。低劑量SCID 小鼠骨髓CD13的陽性率為(5.89 ±1.82)%，與模型組比較有也有顯著差異。見圖2。

圖2 夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)白血病模型小鼠骨髓細(xì)胞CD3 表達(dá)

2.4 夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，夜香樹提取物nocturnoside A 中劑量組和陽性對(duì)照組pAKTT308、pAKTS473的表達(dá)水平均顯著低于模型組，而PTEN 蛋白的表達(dá)水平明顯升高，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。見表2 和圖3。

表2 夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達(dá)的影響

圖3 蛋白印跡法檢測(cè)夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)SCID 小鼠脾臟組織中pAKTT308、pAKTS473、AKT 及PTEN 蛋白的表達(dá)的影響

3 討論

目前白血病的治療仍采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復(fù)發(fā)率高，而且對(duì)正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害［8］。研究白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及逆轉(zhuǎn)機(jī)制已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最熱點(diǎn)的前沿課題之一。目前臨床上常用的白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但它們的治療范圍多局限于粒系白血病，而且仍有一定的毒副作用。從中藥中尋找和提取有效分化誘導(dǎo)劑已經(jīng)成為治療白血病的希望和重要途徑。近來研究發(fā)現(xiàn):夜香樹甾體皂苷體外對(duì)K562 細(xì)胞有很好的增殖抑制作用，本研究以人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562 建立的白血病SCID 模型小鼠，通過以下幾方面觀察夜香樹提取物nocturnoside A 體內(nèi)對(duì)白血病SCID 模型小鼠的抑制作用。

3.1 發(fā)病情況 給予白血病動(dòng)物模型夜香樹提取物nocturnoside A 后，與空白組相比較，從外部癥狀上可見夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)白血病有一定的藥理作用，表現(xiàn)為白血病動(dòng)物的精神、活動(dòng)有所好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量增加，存活率延長(zhǎng)。

3.2 外周血象 白血病模型小鼠外周血明顯升高，外周血可見大量白血病細(xì)胞;給予夜香樹提取物nocturnoside A 14 d 后小鼠外周血白細(xì)胞明顯降低，提示夜香樹提取物nocturnoside A 在體內(nèi)可以抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3.3 SCID 小鼠CD13 陽性率的表達(dá) CD13 是檢測(cè)髓性白血病細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，夜香樹提取物nocturnoside A 對(duì)白血病模型小鼠骨髓、肝、脾、腎等組織均有有一定的陽性表達(dá)。

為闡明夜香樹提取物nocturnoside A 體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用Western blot 法檢測(cè)了脾臟組織中PI3K、AKT 及PTEN 的表達(dá)水平，結(jié)果表明，PI3K 表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)PTEN 的表達(dá)水平增高，由此證實(shí)夜香樹提取物nocturnoside A 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中，PI3K、AKT 及PTEN 可能扮演了重要角色。

Akt 又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。Akt 是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要的信號(hào)分子。近年來Akt 作為一種原癌基因越來越受到關(guān)注，因?yàn)樗幱诩?xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑的交叉口，充當(dāng)著由生長(zhǎng)因子發(fā)動(dòng)的能活化P13K 許多作用的信使，而在研究中人們又發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)促生存蛋白的激活(磷酸化Akt)能促進(jìn)肝癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的存活和阻遏細(xì)胞的凋亡，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝等活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用［9-11］。本實(shí)驗(yàn)研究表明夜香樹提取物nocturnoside A 能顯著降低P-Akt 蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。PTEN 不僅在細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡中起重要作用，在細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移及分化的調(diào)節(jié)等細(xì)胞生理方面也有重要作用。PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，通過控制活化的磷酸酯3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)來調(diào)控AKT 的活性。PTEN 的突變、失活可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路活化狀態(tài)的改變，而其與惡性腫瘤的多種生物學(xué)行為相關(guān)［12-13］。癌組織中存在PTEN基因突變，在癌組織中PTEN 的蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織和正常組織。這進(jìn)一步證實(shí)了PTEN 的失活是腫瘤常見的分子事件，PTEN 可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究表明夜香樹提取物nocturnoside A 可以顯著地提高SCID 小鼠脾臟組織內(nèi)PTEN 蛋白的表達(dá)，從而抑制K562 在SCID 小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。

夜香樹提取物nocturnoside A 在體內(nèi)能對(duì)髓系白血病有一定的抑制作用，其機(jī)制可能是通過下調(diào)CD13 陽性表達(dá)率和PI3K 蛋白的表達(dá)水平，以及上調(diào)AKT、PTEN 蛋白的表達(dá)水平從而阻礙PI3K/Akt 信號(hào)通路的形成，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖而達(dá)到治療髓系白血病。

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