藏藥二十味沉香丸對(duì)暴露高原的大鼠血清及肺組織eNOS 蛋白表達(dá)的影響

李生花， 曹成珠， 楊春燕， 楊全余， 嚴(yán)云飛， 王建新， 靳國(guó)恩

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧810001)

在高原，氧濃度十分低，部分人由于代償能力差，能量代謝出現(xiàn)嚴(yán)重不足，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，出現(xiàn)病理性的改變，甚至危及生命。高原性肺動(dòng)脈高壓(High altitude pulmonary artery hypertension，HAPH)是高原地區(qū)常見病和高發(fā)病，不同年齡段皆可發(fā)病。以肺動(dòng)脈高壓為主要病理特征，嚴(yán)重時(shí)可引起右心室結(jié)構(gòu)和功能的改變。肺動(dòng)脈壓的維持關(guān)鍵在于肺血管收縮系統(tǒng)和舒張系統(tǒng)能夠保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，就會(huì)出現(xiàn)HAPH。NO 是目前已知的由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的最重要的血管舒張因子，是精氨酸在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的作用下轉(zhuǎn)化成瓜氨酸的產(chǎn)物。因此，eNOS具有調(diào)節(jié)血壓，防止白細(xì)胞黏附引起的動(dòng)脈粥樣硬化和平滑肌細(xì)胞增殖的作用［1］，也有人研究［2］發(fā)現(xiàn)患有肺動(dòng)脈高壓的新生兒肺組織中存在eNOS 的高表達(dá)，這可能與圍產(chǎn)期循環(huán)適應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)。增加eNOS 高表達(dá)能夠減弱ROS介導(dǎo)的肺動(dòng)脈血管收縮反應(yīng)［3］。

藏藥二十味沉香丸除能減弱血管收縮力之外［4］，是否也具有促進(jìn)血管舒張而發(fā)揮抗缺氧的作用，尚沒有臨床記載。本研究將闡明eNOS 是否參與了對(duì)高原性肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控，從而起到中藏藥特有的調(diào)理作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 將165 只雄性Wistar 大鼠(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK［川］2009-09)由成都空運(yùn)至西寧(海拔2 260 m)，隨機(jī)分為平原對(duì)照組(LC，n =15)、高原對(duì)照組1、3、7、15、30 d 組(HC，15 只/組)和高原給藥組1、3、7、15、30 d 組(HD，15只/組)。平原組到達(dá)西寧當(dāng)日測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)和采取形態(tài)學(xué)及分子生物標(biāo)本并保存于相應(yīng)的溫度環(huán)境下。高原對(duì)照組和高原給藥組大鼠當(dāng)天從西寧直接運(yùn)至海拔4 500 m(果洛州花石峽鎮(zhèn))地區(qū)。高原對(duì)照組用0.9%生理鹽水灌胃，高原給藥組用藏藥二十味沉香丸制成的水劑 (0.1 g/mL)，按1 mL/100 g 灌胃。于規(guī)定日測(cè)相應(yīng)生理指標(biāo)并采集標(biāo)本，儲(chǔ)存于液氮保存。

1.1.2 藏藥二十味沉香丸［8 g/ (d·60 kg)］，購(gòu)自青海省金訶藏藥集團(tuán)。

1.1.3 試劑儀器 25%烏拉坦(江蘇東邦醫(yī)藥化工有限公司)，eNOS 測(cè)定ELISA 試劑盒和NOS 免疫印跡試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)分別是sc-49058、sc-49055，美國(guó)Santa Cruz 公司)。MP150 十六導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng) (美國(guó)BioPac 公司)，酶標(biāo)儀(ELX800，美國(guó)BIO-TEK 公司)，mini protean 3 cell 電泳儀(美國(guó)BIO-RAD 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清學(xué)測(cè)定 從頸內(nèi)靜脈采集全血，3 000 r/min離心25 min 獲取血清，儲(chǔ)存于液氮。

1.2.2 肺動(dòng)脈壓測(cè)定 每只大鼠用25%烏拉坦麻醉(125 mg/100 g 體質(zhì)量)，麻醉平穩(wěn)后，分離出右側(cè)頸外靜脈，用肝素化的彎頭聚次亞乙烯管(內(nèi)徑0.28 mm)沿頸外靜脈插入，直至肺動(dòng)脈，插管位置利用其典型波形進(jìn)行確定，壓力換能器終端連接MP150 十六導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)(美國(guó)BIOPAC 公司)，通過顯示器觀察波形變化，并用相關(guān)軟件進(jìn)行采集和分析。測(cè)完后立即處死大鼠，測(cè)定左右心室比值，收集血清于液氮保存。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 HE 染色法對(duì)不同組大鼠肺組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片、染色。光鏡下觀察。

1.2.4 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)血清NOS 的量和免疫印跡法測(cè)定肺組織中的eNOS 表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 11.5 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行多組方差分析檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 藏藥二十味沉香丸對(duì)暴露于高海拔不同時(shí)間的大鼠肺動(dòng)脈壓、血清e(cuò)NOS 表達(dá)水平的干預(yù)作用 見表1。

表1 三個(gè)組大鼠不同時(shí)間段PAP 和血清e(cuò)NOS 水平比較(±s)(1 mmHg=0.133 kPa)

表1 三個(gè)組大鼠不同時(shí)間段PAP 和血清e(cuò)NOS 水平比較(±s)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:與平原組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與高原對(duì)照組相比，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別PAP/mmHg 血清e(cuò)NOS/(ng·mL -1)1 d 3 d 7 d 15 d 30 d 1 d 3 d 7 d 15 d 30 d平原組(n=15)20.18 ±3.26 — — — — 13.31 ±0.85————12.65 ±1.71高原藥物組(n=75)高原對(duì)照組(n=75)18.31 ±0.22 23.07 ±3.39 32.24 ±5.4＊＊30.00 ±2.81＊＊48.12 ±11.9＊＊16.25 ±3.11*20.96 ±1.51＊＊16.91 ±3.40＊＊13.65 ±1.39*20.65 ±2.80 22.14 ±2.93 25.29 ±3.02ΔΔ 23.78 ±4.8ΔΔ 27.03 ±4.27ΔΔ 17.33 ±2.44 19.39 ±0.85Δ 20.51 ±1.51Δ 19.00 ±2.66ΔΔ 16.61 ±4.22 Δ

從表1 可以看出，無論是高原對(duì)照組還是高原藥物組，隨在高原生活時(shí)間的延長(zhǎng)，其肺動(dòng)脈壓呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，與平原組相比P ＜0.01，但高原對(duì)照組增長(zhǎng)幅度遠(yuǎn)大于高原藥物組，在低氧30 d 內(nèi)其增長(zhǎng)幅度是高原藥物組的4倍，顯示出藏藥二十味沉香丸具有較好的抗缺氧效果。

在高原對(duì)照組，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)于低氧早期就有所升高，特別在第3 天達(dá)到高峰，與平原對(duì)照組相比有顯著性差異(P ＜0.01)，第7 天開始下降，于第30天下降至平原對(duì)照組水平，甚至更低。有趣的是高原藥物組中eNOS 蛋白表達(dá)水平完全不同于高原對(duì)照組，與平原對(duì)照組相比，在暴露低氧30 d 的過程中，一直處于高表達(dá)水平(P ＜0.01)，特別是第7 天起，其水平均超過了高原對(duì)照組。雖然第15 天以后開始下降，但遠(yuǎn)高于平原對(duì)照組和高原對(duì)照組(P ＜0.01)。

2.2 高原對(duì)照組和高原藥物組肺組織形態(tài)學(xué)特征 慢性低氧引起肺動(dòng)脈高壓的主要環(huán)節(jié)就是肺血管重建，即動(dòng)脈血管壁增厚和肌性化。圖1 顯示隨著暴露低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，肺動(dòng)脈壁逐漸增厚，尤其是高原對(duì)照組增厚十分明顯，并有散在出血點(diǎn)。雖然藏藥組肺動(dòng)脈壁也呈現(xiàn)與時(shí)間成正比的增厚趨勢(shì)，但相比高原對(duì)照組，這種增厚并不明顯，也不足于影響其運(yùn)輸血的功能。

我們對(duì)兩個(gè)組不同時(shí)間肺動(dòng)脈壁厚度進(jìn)行了測(cè)量，見表2。肺動(dòng)脈壁厚度7 d 前在高原對(duì)照組和高原藥物組之間無差異，7 d 后開始出現(xiàn)顯著差異，至30 d 后高原對(duì)照組肺動(dòng)脈璧厚度是高原藥物組的2 ～3 倍(P ＜0.01)。

表2 高原對(duì)照組和高原藥物組大鼠肺血管壁厚度比較

圖1 高原對(duì)照組和高原藥物組大鼠動(dòng)脈血管平滑肌層結(jié)構(gòu)圖(HE 染色，×200)

2.3 藏藥二十味沉香丸對(duì)肺組織eNOS 蛋白表達(dá)的影響高原對(duì)照組和高原藥物組中，eNOS 蛋白在肺組織中的表達(dá)是不同的，高原對(duì)照組中該蛋白表達(dá)量很高，特別是第7天、第15 天為最高，第30 天略有下降，但仍高于低氧第1天和第3 天;在高原藥物組該蛋白在第1 天就開始升高，并保持在較高水平上，第15 天和第30 天開始降低，但仍高于高原對(duì)照組第1 天和第3 天，但隨著時(shí)間越長(zhǎng)，eNOS蛋白表達(dá)水平逐漸減弱。見圖2。

圖2 高原對(duì)照組和高原藥物組肺組織eNOS 水平表達(dá)

從其灰度值(表3)可以看出，低氧明顯增加eNOS 表達(dá)，特別是在高原對(duì)照組第7 天開始相當(dāng)明顯。高原藥物組雖然低于高原對(duì)照組，但經(jīng)過藥物干預(yù)后，eNOS 蛋白水平一直處于較高水平。平原組eNOS 水平(537.1 ±79.4)并不高，相比低氧第1 天的eNOS 表達(dá)無明顯差異。表明正常情況下，eNOS 在機(jī)體并不升高，僅僅保持一定的濃度以維持其正常生理功能，只有如低氧刺激下，其表達(dá)才會(huì)增加，以對(duì)抗一些縮血管因子的作用。

3 討論

高原性肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制包括血管收縮和血管重建，其中血管收縮機(jī)制涉及神經(jīng)、激素和一些內(nèi)皮細(xì)胞釋放的因子，是肺血管收縮和舒張力量失平衡而致。單從細(xì)胞因子看，目前研究最多的具有收縮血管作用的因子有ET-1［5］，5-HT［6］，血管 緊 張 素Ⅱ［7］等，舒 張 因 子 有NO［8］、H2S、CO、腺苷等。本研究發(fā)現(xiàn)藏藥二十位沉香丸能夠顯著預(yù)防低氧引起的肺動(dòng)脈壓過度升高的作用，其機(jī)制之一就是該藥能夠促進(jìn)eNOS 水平的升高，后者可通過促進(jìn)精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的過程中釋放NO，從而使肺血管舒張，降低血管阻力，防止肺血管壓力過度升高。

在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)平原大鼠移至海拔4 500 m 地區(qū)，其肺動(dòng)脈壓會(huì)升高，肺血管壁增厚，這種變化隨在高原生活時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，特別是高原對(duì)照組在第7 天起改變明顯，這與我們以往的研究結(jié)果一致［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)藏藥二十味沉香丸可能通過促進(jìn)某舒張血管的因子對(duì)抗低氧所致的血管收縮，這個(gè)因子可能就是NO，而eNOS 表達(dá)量能夠間接反應(yīng)NO 水平［11-12］，研究表明低氧初期eNOS水平也明顯升高，低氧后期明顯下降，這可能是機(jī)體代償機(jī)制起作用，目的就是對(duì)抗急性低氧引起的縮血管作用［13-14］，eNOS 釋放呈現(xiàn)先高后低的特征，肺動(dòng)脈壓是否升高或降低，除取決于血管收縮力量之外，也取決于eNOS升高程度或其蛋白降解的時(shí)間。藏藥二十味沉香丸能夠顯著促進(jìn)血清e(cuò)NOS 高表達(dá)，并維持在一個(gè)較高的水平上，延緩其降低的速度，效果特別明顯。說明藏藥二十味沉香丸具有預(yù)防肺動(dòng)脈壓快速升高的作用，干預(yù)eNOS 水平是該藥降低肺動(dòng)脈壓的機(jī)制之一。

有趣的是，eNOS 水平在血清和肺組織中的表達(dá)并不一致，無論高原對(duì)照組或藥物組大鼠血清e(cuò)NOS 蛋白表達(dá)與肺動(dòng)脈壓變化一致。但在高原對(duì)照組大鼠肺組織中eNOS并未呈現(xiàn)先高后低的特點(diǎn)，而是第7 天開始才增加，并維持在一個(gè)較高的水平，按理肺動(dòng)脈壓應(yīng)該下降，但結(jié)果恰恰相反，原因不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究。高原藥物組大鼠血清e(cuò)NOS 水平在暴露高原第1 天和第3 天有所升高，并維持在一個(gè)較高的水平，第30 天顯著降低，但總體看其表達(dá)量不如高原對(duì)照組，與血清該蛋白表達(dá)水平不一致?；蛟S能夠調(diào)節(jié)血管張力引起的肺動(dòng)脈壓的eNOS 主要存在于血清，而肺組織eNOS 或許參與了低氧后期的血管重建，從我們的研究發(fā)現(xiàn)，藏藥二十位沉香丸對(duì)預(yù)防低氧早期引起的肺動(dòng)脈高壓有顯著效果，但對(duì)預(yù)防低氧后期由于血管重建引起的肺動(dòng)脈高壓效果明顯減弱，也許這與肺組織中eNOS 蛋白水平低有關(guān)。

總之，藏藥二十味沉香丸具有較好的干預(yù)肺動(dòng)脈高壓形成的作用，但由于藥物成分復(fù)雜，其作用機(jī)制也極其復(fù)雜。而低氧初期能夠顯著促進(jìn)NOS 水平僅為其作用機(jī)制之一。

致謝:花石峽衛(wèi)生院、青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心在本研究中所給予的大力支持和幫助。

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