反相HPLC 法同時測定復(fù)方黃連素片中的8 種成分

陳燕軍， 吳有根， 方海紅， 金浩鑫， 魏惠珍

(1. 江西師范大學(xué)，江西 南昌330027;2. 南昌職業(yè)學(xué)院，江西 南昌330050;3. 江西科技師范大學(xué)，江西南昌330013;4. 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西南昌330006)

復(fù)方黃連素片是中西藥復(fù)方制劑，為《中國藥典》2010 年版一部收載品種，具有清熱燥濕、行氣止痛、止痢止瀉之功效，由鹽酸小檗堿、木香、吳茱萸、白芍四味藥組成。其中，鹽酸小檗堿為主藥，具有廣譜抗菌作用;木香、白芍行氣止痛，緩解臍周脹痛及痢疾里急后重，能抑制痢疾桿菌;吳茱萸溫中散寒，并制黃連之苦寒［1-3］。

目前，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［2］僅采用鹽酸小檗堿和芍藥苷作為復(fù)方黃連素片的質(zhì)量控制指標(biāo)，而無木香和吳茱萸的定量分析。因此，為了更好地評價該藥物的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［4-11］，建立了同時測定8 個指標(biāo)性成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、鹽酸小檗堿、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的方法。經(jīng)驗(yàn)證，該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為全方面、多指標(biāo)評價復(fù)方黃連素片的質(zhì)量提供一種思路。

1 儀器與試藥

島津LC10-AT HPLC 色譜儀;AUW-220D 型電子天平(日本島津公司);梅特勒AB-104N 型電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

對照品芍藥苷(批號110727-201438)、鹽酸小檗堿(批號110713-201212)、吳茱萸內(nèi)酯(批號110800-201205)、吳茱萸堿 (批號110802-201409)、吳茱萸次堿(批號110801-201207)、木香烴內(nèi)酯(批號111524-201208)、去氫木香內(nèi)酯(批號111525-201209)均購自中國食品藥品檢定研究院;芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號20130901，純度≥97%)購自中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心。復(fù)方黃連素片購自市場(批號分別為140811、140915、141013)。乙腈為色譜純(德國Merck 公司);磷酸二氫鉀為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 月旭XB-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-0.03 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～10 min，18% ～20%A;10 ～15 min，20% ～25%A;15 ～30 min，25% ～45%A;30 ～50 min，45% ～60%A;50 ～60 min，60% ～70% A);體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長220 nm。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加80% 甲醇溶液制成質(zhì)量濃度分別為26.8、40.2、66.4、16.8、17.3、15.6、23.8、26.4 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(250 W、40 kHz)30 min，放冷，80%甲醇溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液用于測定除鹽酸小檗堿以外的其他成分，即得。再精密量取續(xù)濾液2 mL，置于100 mL 量瓶中，80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用于測定鹽酸小檗堿。

2.4 陰性樣品溶液的制備 分別取不加白芍、木香、吳茱萸、鹽酸小檗堿的陰性樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法配制陰性樣品溶液，即得，HPLC色譜圖見圖1。

2.5 線性試驗(yàn) 分別取混合對照品溶液2、5、10、15、20、25、30 μL，注入HPLC 色譜儀中分析，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，得到芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的回歸方程。分別為Y =2 859 499X -10 196，r =0.999 6;Y=4 886 426X+6 188，r=0.999 9;Y=2 567 287X-6 883，r=0.999 7;Y=494 034X-277，r=0.999 9、Y=8 149 519X-10 112，r=0.999 5;Y=2 600 093X+1 352，r = 0.999 8;Y = 2 108 095X + 1 332，r =0.999 6;Y=2 734 223X +4 571，r =0.999 8。并且各成 分 在0.054 ～0.804 μg、0.080 ～1.21 μg、0.132 ～1.99 μg、0.034 ～0.504 μg、0.035 ～0.519 μg、0.031 ～0.468 μg、0.048 ～0.714 μg、0.053 ～0.792 μg 范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(批號140915)適量，重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、鹽酸小檗堿、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的峰面積RSD 分別為1.4%、1.8%、0.79%、1.0%、1.8%、0.56%、1.2%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取復(fù)方黃連素片(批號140915)6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析測定。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷的含有量為1.94 mg/g，RSD 為2.0%;芍藥苷的含有量為2.42 mg/g，RSD 為2.0%;鹽酸小檗堿的含有量為101.2 mg/g，RSD 為1.3%;吳茱萸內(nèi)酯的含有量為1.40 mg/g，RSD 為1.5%;吳茱萸堿的含有量為0.58 mg/g，RSD 為0.72%;吳茱萸次堿的含有量為0.56 mg/g，RSD 為1.1%;木香烴內(nèi)酯的含有量為1.08 mg/g，RSD 為0.88%;去氫木香內(nèi)酯的含有量為2.34 mg/g，RSD 為0.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的復(fù)方黃連素片 (批號140915)6 份，每份0.25 g，分別加入芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯混合對照品溶液適量，以及鹽酸小檗堿對照品約25 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明該方法回收率良好。

2.9 樣品測定 精密稱取復(fù)方黃連素片0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

3 討論

在供試品的制備方法中，本實(shí)驗(yàn)考察了60%、80%、90%甲醇溶液及超聲處理20、30、40 min時的提取效果。結(jié)果表明，80%甲醇溶液、超聲處理30 min 時就可有效提取樣品中的待測成分。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of recovery tests

表2 復(fù)方黃連素片中8 種成分的含有量(mg·g -1，n=3)Tab.2 Contents of eight constituents in Compound Huangliansu Tablets (mg·g -1，n=3)

另外，樣品中鹽酸小檗堿的含有量明顯高于其他7 種成分，無法同時測定。而如果將樣品稀釋50 倍后，則在同樣色譜條件下，可準(zhǔn)確測定鹽酸小檗堿的含有量。

本實(shí)驗(yàn)將《中國藥典》2010 年版復(fù)方黃連素片中測定鹽酸小檗堿和芍藥苷的色譜條件與樣品的制備方法作了統(tǒng)一，同時測定了該藥物中其他6 個有效成分，有利于復(fù)方黃連素片的質(zhì)量控制，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一種新的方法。

［1］ 林 林，林永強(qiáng)，汪 冰，等. HPLC 波長切換技術(shù)同時測定復(fù)方黃連素片中6 個成分的含量［J］. 藥物分析雜志，2014，34(1):96-99.

［2］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:923.

［3］ 李玉恒，張振秋，賴靜怡，等. HPLC 波長切換技術(shù)同時測定萸連片中7 種成分含量［J］. 藥物分析雜志，2011，31(2):371-375.

［4］ 伍振峰，傅聲玲，胡鵬翼，等. HPLC 法同時測定戊己方提取物中5 個成分的含量［J］. 藥物分析雜志，2013，33(6):950-954.

［5］ 張敏娟，黃秀梅，姜世賢，等. HPLC 和UPLC 法測定復(fù)方黃連素片中吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的方法比較［J］.藥物分析雜志，2012，32(11):2077-2081.

［6］ 丁世蘭，崔元璐，張 葉，等. 切換波長HPLC 同時測定左金丸乙醇提取物中7 種生物堿的含量［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(15):66-70.

［7］ 宋亞芳，王智民，朱晶晶，等. 一測多評法測定吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量［J］. 中國中藥雜志，2009，34(21):2781-2785.

［8］ 吳永芹，趙新靜，閻道輝，等. HPLC 法測定復(fù)方黃連素片中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量［J］. 齊魯藥事，2009，28(10):596-598.

［9］ 劉曉哲，張東方. HPLC 同時測定復(fù)方黃連素片中3 種成分的含量［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(1):70-73.

［10］ 黃山君，楊琪偉，石燕紅，等. 一測多評法測定白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的含量［J］. 中國中藥雜志，2011，36(6):780-783.

［11］ 李捷瑋，金柔男，李 翔，等. 多種中成藥中芍藥苷的含量測定［J］. 藥物分析雜志，2009，29(9):1440-1443.