制備波棱瓜子總木脂素納米混懸劑

沈 剛， 李娟娟， 程 玲， 沈成英， 宋啟瑞， 韓 晉 ， 袁海龍

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137;2. 中國人民解放軍第302 醫(yī)院，北京100039)

波棱瓜子系葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall 的干燥成熟種子，為常用藏藥?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥標(biāo)準(zhǔn))》1995 年版記載，其味苦，性寒，能清腑熱、膽熱，具有清熱解毒、去火降熱、助消化的作用，用于治療肝熱、黃疸性傳染型肝炎等癥［1］。本課題組前期研究表明，波棱瓜子抗肝炎的有效部位為總木脂素，主 要 由 herpetrione、herpetin、herpetetrone、herpetotriol、herpetal 等成分組成［2-3］。然而，由于木脂素類成分的水溶性較差，導(dǎo)致其口服生物利用度低，制約了抗肝炎的臨床療效。

納米混懸劑(nanosuspensions，NS)作為難溶性藥物的新型給藥系統(tǒng)，能顯著改善難溶性藥物的口服生物利用度，從而提高療效［4］。其中，高壓均質(zhì)技術(shù)作為納米混懸劑制備的常用方法，具有工藝簡單、重復(fù)性好、可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)［5］。但是，當(dāng)藥物顆粒過大時(shí)，往往存在堵塞高壓均質(zhì)機(jī)限流縫隙的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)其硬度過大時(shí)也不易形成納米尺寸，而沉淀法聯(lián)合高壓均質(zhì)能降低該技術(shù)的能耗和堵塞風(fēng)險(xiǎn)［6］。

波棱瓜子總木脂素(total lignans from Herpetospermum caudigerum，HTL)中的大部分化合物都含有酚羥基結(jié)構(gòu)［3］，其溶解度受pH 影響。據(jù)此性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用pH 依賴的溶解-沉淀法代替溶劑沉淀法聯(lián)合高壓均質(zhì)技術(shù)，用于制備波棱瓜子總木脂素納米混懸劑，并利用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法來優(yōu)化處方，同時(shí)對(duì)其凍干粉進(jìn)行理化性質(zhì)表征和體外溶出行為考察。

1 儀器與材料

Nano DeBEE 超高壓均質(zhì)機(jī)(美國必宜DeBEE公司);S-4800 掃描電鏡(日本日立公司);Winner801 納米激光粒度儀(濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司);D/Max 2500PC X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司);LGJ-18 冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠);RC-3 溶出度測試儀(天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司);LC-20A 島津液相色譜儀(日本島津公司);85-2 恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)。

波棱甲素對(duì)照品(自制，純度大于98%，批號(hào)121205);波棱瓜子總木脂素原料藥(本實(shí)驗(yàn)室制備，以波棱甲素計(jì)，總木脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.34%，波棱甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.8%);十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚維酮K30 (PVP K30)、甘露醇(北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司)。乙腈為色譜純 (德國Merck 公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料藥中總木脂素的測定［7］精密稱取波棱甲素對(duì)照品10.00 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度線，即得到0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液。

精密吸取上述對(duì)照品溶液80、100、150、200、250、300 μL，分別置于10 mL 量瓶中，加入10%變色酸水溶液1 mL 和濃硫酸6 mL，蒸餾水定容，沸水浴中放置30 min 后取出，用流水冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照。按照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010 年版一部附錄VA)，在570 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(A)、質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(C)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A =0.044 3C -0.015 9，r =0.999 3，表明在3.2 ～12.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密稱取原料藥細(xì)粉5.0 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度線，再精密吸取1 mL，置于50 mL 量瓶中，加入10%變色酸水溶液5 mL 和濃硫酸30 mL，蒸餾水定容，沸水浴中放置30 min 后取出，用流水冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照。然后，測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中波棱甲素的含有量，結(jié)果測得原料藥中總木脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以波棱甲素計(jì))為82.34%。

2.2 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑的制備 取原料藥10 ～20 mg，溶于0.1 mol/L NaOH 溶液(5 mL)和乙醇(5 mL)的混合溶劑中，超聲溶解，然后將上述溶液在800 r/min 磁力攪拌條件下，緩慢注入到含SDS (2 ～4 mg)和PVP K30 (2 ～4 mg)的水溶液(90 mL)與0.1 mol/L HCl 溶液(5 mL)的混合溶液中。接著，將上述混懸液轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機(jī)，1 000 bar 壓力下循環(huán)10 次，即得。

2.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化波棱瓜子總木脂素納米混懸劑制備的處方 經(jīng)前期試驗(yàn)考察，選擇藥物質(zhì)量濃度(X1)、SDS 質(zhì)量濃度(X2)和PVP K30 質(zhì)量濃度(X3)為參考因素，其水平和編碼見表1。然后，以波棱瓜子總木脂素納米混懸劑平均粒徑(Y)為響應(yīng)值，采用3 因素3 水平的Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化波棱瓜子總木脂素納米混懸劑制備處方，設(shè)計(jì)安排及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)安排及結(jié)果Tab.2 Arrangement and result of Box-Behnken design

表3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab.3 Statistical analysis result

2.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 應(yīng)用Design-Expert 8.0.7.1 軟件，繪制不同影響因素的效應(yīng)面圖(圖1)，可知波棱瓜子總木脂素納米混懸劑的粒徑受到藥物、SDS 和PVP K30 三者的共同影響，粒徑隨著PVP K30 用量的增加，先降后升，而隨著藥物和SDS 用量的增加，呈非線性增加。根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，得到優(yōu)化后的處方為X1=10，X2=3.3，X3=2.1。按照此優(yōu)化處方，制備了3 批波棱瓜子總木脂素納米混懸劑，并測定其粒徑，結(jié)果測得實(shí)測值為(306.15 ±7.06)nm，和預(yù)測值277.06 nm 較接近，表明該模型的預(yù)測性良好。

圖1 各因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖Fig.1 3D response surface plot for the effects of each factor on response value

2.4 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉的制備與驗(yàn)證 將按優(yōu)化處方制得的波棱瓜子總木脂素納米混懸劑中加入5%甘露醇，-80 ℃冰箱中預(yù)冷凍24 h，再置于壓力0.10 mbar，溫度-50 ℃冷凍干燥機(jī)中冷凍72 h 后取出，即得凍干粉。然后，按處方比例稱取原輔料適量，驗(yàn)證波棱瓜子總木脂素納米混懸劑及其凍干粉的制備工藝，得到疏松的淺黃色凍干粉，結(jié)果見表4。

表4 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干前后的粒徑和多分散度指數(shù)(PI)Tab.4 Particle sizes and polydispersity indices (PI)of HTL-NS before and after lyophilization

2.5 波棱瓜子總木脂素物理混合物的制備 稱取干燥至恒定質(zhì)量的波棱瓜子總木脂素原料藥適量，并按制備其納米混懸劑的處方比例稱取輔料適量，加蒸餾水混勻，再加5%甘露醇，在“2.4”項(xiàng)條件下冷凍干燥，即得。

2.6 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑的表征

2.6.1 粒徑分析 分別稱取波棱瓜子總木脂素納米混懸劑和凍干粉適量，加蒸餾水稀釋至適宜的濃度，Winner-801 納米激光粒度儀測定其粒徑及多分散度指數(shù)(PI)，共3 批，每批測定3 次，取平均值，結(jié)果見表4。由表可知，波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉復(fù)溶后的平均粒徑為(345.05 ±7.59)nm，PI 為0.187 ±0.010，較凍干前變化不大，表明該凍干工藝的固化效果和再分散性能良好。

2.6.2 形態(tài)觀察 取波棱瓜子總木脂素原料藥和其納米混懸劑凍干粉適量，于掃描電鏡(SEM)下觀察其形態(tài)并拍攝照片，結(jié)果見圖2，由圖可知，原料藥在SEM 下呈不規(guī)則塊狀，而納米混懸劑呈不規(guī)則球形，大小較均勻。

圖2 掃描電鏡圖Fig.2 Images taken on scanning electron microscope

2.7 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑溶出度的測定

2.7.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-2% 冰醋酸(22 ∶78);體積流量1.0 mL/min;檢測波長280 nm;柱溫室溫;進(jìn)樣量10 μL。

2.7.2 供試品溶液的制備 稱取波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉適量，磷酸鹽緩沖液(pH 為7.5)超聲溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.7.3 專屬性考察 按處方比例稱取缺波棱瓜子總木脂素原料藥的輔料適量，制成空白納米混懸液凍干粉，再按“2.7.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液相同的保留時(shí)間處未見色譜峰，表明輔料對(duì)波棱甲素的測定無干擾，見圖3。

2.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液適量，用甲醇按不同比例稀釋，得到2、10、20、40、60、80 μg/mL 對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(C)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(A)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A=13 733C+6 310.5 (r =0.999 6)，表明波棱甲素在2 ～80 μg/mL 呈良好的線性關(guān)系。

圖3 專屬性考察HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms for specificity investigation

2.7.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為40 μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，平行測定6 次，計(jì)算精密度。結(jié)果顯示，波棱甲素峰面積RSD 為1.41%，表明該儀器精密度良好。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉100 mg，按照“2.7.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣10 μL 測定。結(jié)果顯示，波棱甲素峰面積RSD值為1.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12 h 注入HPLC 色譜儀，測定峰面積。結(jié)果顯示，波棱甲素峰面積RSD 值為0.35%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取波棱甲素含有量已知的波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉適量，共6 份，分別加入pH 為7.5 的磷酸鹽緩沖液和精密量取的波棱甲素對(duì)照品，超聲溶解，混勻，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果，回收率均在98.21% ～101.98%之間，RSD 為1.85%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.9 體外溶出率的測定 取波棱瓜子總木脂素納米混懸劑凍干粉及其物理混合物各0.4 g，共3份，按《中國藥典》2010 年版二部 (附錄XC)槳法測定溶出度。在(37 ±1)℃溫度下，以磷酸鹽緩沖液(pH 為7.5)900 mL 為釋放介質(zhì)［8］，攪拌速度為100 r/min，待其平穩(wěn)后，將膠囊投進(jìn)溶出杯中，從接觸溶媒起立即計(jì)時(shí)，分別于5、10、15、20、30、45、60 min 取樣1 mL，并補(bǔ)充相同溫度體積的新鮮溶出介質(zhì)，樣品經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算累積溶出度，結(jié)果見圖4。由圖可知，物理混合物的最大累積溶出率只有39.67%，而波棱瓜子總木脂素納米混懸劑在20 min 時(shí)的累積溶出率可達(dá)85.00%，溶出效果明顯優(yōu)于物理混合物，表明將難溶性藥物波棱瓜子總木脂素制備成納米混懸劑后，其溶出度得到顯著改善。

圖4 波棱瓜子總木脂素納米混懸劑和物理混合物的溶出曲線圖Fig.4 Dissolution curves of HTL-NS and HTL physical mixture

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道［9］，PVP K30 是一種聚合物，可包裹在納米粒子表面，使粒子間產(chǎn)生空間排斥，能防止Ostwald 熟化和團(tuán)聚等現(xiàn)象的發(fā)生，但是濃度較低時(shí)，不能完全包裹納米粒子表面，而濃度較高時(shí)，溶液黏度增大，粒子凝聚，導(dǎo)致粒徑變大［10］。SDS是一種離子型表面活性劑，具有靜電作用，能減小納米化過程中產(chǎn)生的過多的表面能。研究發(fā)現(xiàn)［11］，聯(lián)用這兩種類型的穩(wěn)定劑可使制劑具有更好的穩(wěn)定性。根據(jù)析晶理論，只有晶核形成快而成長慢，才能得到最小粒徑的穩(wěn)定混懸液，所以藥物過飽和時(shí)，結(jié)晶生長快，產(chǎn)生Ostwald 熟化，使粒徑變大［12］。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)波棱瓜子總木脂素中的大部分化合物都含有酚羥基結(jié)構(gòu)，溶解度受pH 影響的特點(diǎn)，采用pH 依賴的溶解沉淀法聯(lián)合高壓均質(zhì)技術(shù)，用于制備波棱瓜子總木脂素納米混懸劑。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，波棱瓜子總木脂素在堿性溶液中不能完全溶解，而加入適量乙醇后可促進(jìn)其溶解［13］，當(dāng)堿性溶液與乙醇的體積比為1 ∶1 時(shí)，波棱瓜子總木脂素能得到較好溶解，故在制備過程中加入了5 mL乙醇。波棱瓜子總木脂素納米混懸劑在凍干前后，粒徑增加了近50 nm，這是因?yàn)槠湓诠腆w化過程中隨著水分的散失，存在“固化損傷”現(xiàn)象［14］，粒子之間發(fā)生不可逆的聚合、團(tuán)聚、增長等現(xiàn)象，使凍干粉的再分散性能降低，粒徑變大，但增加的粒徑在合理的范圍內(nèi)，影響不大。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用pH 依賴的溶解沉淀法聯(lián)合高壓均質(zhì)技術(shù)能成功制備波棱瓜子總木脂素納米混懸劑，而且其粒徑小，以無定型狀態(tài)存在，體外溶出行為良好，可為弱酸弱堿類難溶性藥物有效部位的納米化提供新的方法。

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