鹽酸青藤堿對(duì)偏頭痛大鼠中腦PAG 區(qū)域NF-κB、COX-2 和5-HT 表達(dá)的影響

詹 劍， 楊 麗* ， 易桂標(biāo)， 郝仁方， 羅國標(biāo)， 張中菊

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義563003;2. 遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003;3. 貴州省黔南州醫(yī)院，貴州黔南州558000;4. 貴州省遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563003)

隨著對(duì)偏頭痛發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，研究發(fā)現(xiàn):中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)參與中樞疼痛調(diào)控，其結(jié)構(gòu)和功能的紊亂與偏頭痛發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［1］;硬腦膜血管區(qū)域神經(jīng)源性炎癥的激活則是引發(fā)偏頭痛的重要途徑［2］。目前尚未見PAG區(qū)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)與偏頭痛發(fā)病關(guān)系的報(bào)道。鹽酸青藤堿是近年來發(fā)展起來的一種抗炎鎮(zhèn)痛特效藥，它對(duì)偏頭痛大鼠PAG 區(qū)神經(jīng)源性炎癥的影響和對(duì)偏頭痛的鎮(zhèn)痛效果有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用硝酸甘油偏頭痛大鼠模型，選擇PAG 區(qū)作為觀察部位，采用鹽酸青藤堿進(jìn)行干預(yù)，通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)源性炎癥信號(hào)通路調(diào)控物質(zhì)NFκB、炎癥介質(zhì)COX-2 和中樞性鎮(zhèn)痛神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的表達(dá)變化，探討PAG 區(qū)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)在偏頭痛發(fā)病中的可能作用和鹽酸青藤堿治療偏頭痛的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 清潔級(jí)Wistar 大鼠30 只(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK ［渝］2007-0005)，均為雄性，體質(zhì)量(320 ±60)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、偏頭痛模型組、鹽酸青藤堿治療組，每組10 只。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司，5 mg/mL，批號(hào)20100531);正清風(fēng)痛寧緩釋片(除去包衣，每片含鹽酸青藤堿60 mg，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)0903127);兔抗大鼠5-HT 抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。NF-κB p65 檢測(cè)試劑盒，購自北京中衫金橋試劑公司。COX-2 檢測(cè)試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。KDC-2044 低速冷凍離心機(jī)離心(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳公司生產(chǎn));麥克奧迪BA400 (麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);病理石蠟切片機(jī)Finesse 325 (北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 采用Tassorelli 等［3］介紹的方法制作偏頭痛模型。健康Wistar 雄性大鼠，硝酸甘油注射劑2 mL (10 mg/kg)頸部皮下注射，每天注射1次，一共5 次。鹽酸青藤堿治療組在此基礎(chǔ)上將鹽酸青藤堿按100 mg/(kg·d)灌胃，每天1 次，共5次。空白對(duì)照組皮下注射相同劑量生理鹽水2 mL，每天注射1 次，一共5 次，并在此基礎(chǔ)上以等量的生理鹽水灌胃，每天1 次，共5 次。

1.2.2 行為學(xué)觀察 大鼠在注射硝酸甘油后3 min左右出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多等煩躁不安的癥狀視為模型制作成功，并觀察各組大鼠疼痛行為學(xué)變化，觀察內(nèi)容和方法: (1)撓頭時(shí)間。撓頭出現(xiàn)時(shí)間以大鼠出現(xiàn)連續(xù)撓頭次數(shù)達(dá)5 次以上為起始標(biāo)志，撓頭消失時(shí)間以大鼠出現(xiàn)倦怠、疲乏，一段時(shí)間內(nèi)多次出現(xiàn)連續(xù)撓頭次數(shù)少于5 次為終止標(biāo)志。兩者之間的時(shí)間段可反映偏頭痛持續(xù)時(shí)間。(2)撓頭次數(shù)。從造模之時(shí)起，每30 min 作為一個(gè)時(shí)間段，連續(xù)觀察大鼠每個(gè)時(shí)間段內(nèi)撓頭、爬籠次數(shù)，至造模后210 min 為止。各時(shí)間段撓頭次數(shù)、高峰期撓頭次數(shù)及高峰期持續(xù)時(shí)間可反映偏頭痛嚴(yán)重程度。

1.2.3 取材 最后一次造模在行為學(xué)觀察完成后將大鼠用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定開胸，從心尖部緩慢置入穿刺針達(dá)主動(dòng)脈并固定，剪破右心房。先快速灌注無菌生理鹽水100 ～200 mL，隨后灌注4 ℃4%多聚甲醛液100 ～200 mL，斷頭快速剝離出腦組織，置于4%多聚甲醛液浸泡固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機(jī)切片，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片，烤片機(jī)中58 ℃2 h 烤干備用。石蠟切片取1 張貼于普通載玻片行常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，相鄰石蠟切片再行免疫組化染色。

1.2.4 NF-κB p65、COX-2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法染色，DAB 顯色。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 5-HT 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 應(yīng)用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法染色，顯色。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 圖像分析 麥克奧迪BA400 顯微鏡下:NF-κB 染色陽性細(xì)胞可以呈現(xiàn)質(zhì)染和核質(zhì)共染2 種形式，其中質(zhì)染主要為NF-κB 未發(fā)生核轉(zhuǎn)位的陽性細(xì)胞，核質(zhì)共染主要為NF-κB 發(fā)生了核轉(zhuǎn)位的陽性細(xì)胞，故以核質(zhì)共染形式作為陽性細(xì)胞計(jì)數(shù);隨著NF-κB 表達(dá)程度不同，染色程度呈現(xiàn)棕黃色或棕色。COX-2 陽性細(xì)胞染色較淡，主要為胞漿染成棕黃色。5-HT 陽性細(xì)胞呈三角形或梭形，細(xì)胞漿染成棕褐色。在40 ×10 倍鏡下觀察每張切片左上、右上、左下、右下和中央部5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞總數(shù)，取均值。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 除空白對(duì)照組外，偏頭痛模型組和鹽酸青藤堿治療組大鼠造模后均出現(xiàn)前肢不停撓頭、爬籠次數(shù)增多、雙耳發(fā)紅、煩躁不安等現(xiàn)象類似人類偏頭痛發(fā)作。持續(xù)一段時(shí)間后，繼而出現(xiàn)蜷臥，活動(dòng)減少，逐步趨于正常，觀察結(jié)果如下。

2.1.1 撓頭時(shí)間 偏頭痛模型組大鼠撓頭出現(xiàn)時(shí)間較鹽酸青藤堿治療組大鼠早，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05);偏頭痛模型組大鼠撓頭消失時(shí)間較鹽酸青藤堿治療組大鼠晚，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05);偏頭痛模型組大鼠撓頭持續(xù)時(shí)間較鹽酸青藤堿治療組大鼠長(zhǎng)，兩者存在顯著性差異(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠撓頭出現(xiàn)時(shí)間、撓頭消失時(shí)間和持續(xù)時(shí)間(min，±s)Tab.1 Beginning，lasting and ending time of rats scratching their heads in groups (min，±s)

表1 各組大鼠撓頭出現(xiàn)時(shí)間、撓頭消失時(shí)間和持續(xù)時(shí)間(min，±s)Tab.1 Beginning，lasting and ending time of rats scratching their heads in groups (min，±s)

注:與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n 出現(xiàn)時(shí)間 消失時(shí)間 持續(xù)時(shí)間空白對(duì)照組10 0 0 0偏頭痛模型組 10 3.00±0.26 187.02±7.36 184.02±7.27鹽酸青藤堿治療組 10 3.83±0.17△ 150.52±10.46△146.69±10.43△

2.1.2 撓頭次數(shù) 與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間段偏頭痛模型組和鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭次數(shù)均明顯增多，有顯著性差異(P ＜0.05);與偏頭痛模型組相比，各時(shí)間段鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭次數(shù)均明顯減少，有顯著性差異(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)(次/30 min，±s)Tab.2 Frequency of rats scratching their heads in groups (times/30 min，±s)

表2 各組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)(次/30 min，±s)Tab.2 Frequency of rats scratching their heads in groups (times/30 min，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，◇P ＜0.05;與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n 30 60 90 120 150 180 210空白對(duì)照組 10 1.24 ±0.13 0.68 ±0.26 0.73 ±0.18 0.52 ±0.21 1.03 ±0.17 0.67 ±0.15 0.81 ±0.16偏頭痛模型組 10 31.80 ±4.34◇ 45.00 ±4.35◇ 43.00 ±3.06◇ 33.1 ±3.00◇ 21.4 ±1.58◇ 10.60 ±1.90◇ 3.90 ±1.20◇鹽酸青藤堿治療組 10 27.30 ±2.98◇△35.80 ±2.74◇△27.00 ±2.21◇△ 8.20 ±1.87◇△ 5.11 ±0.92◇△ 2.50 ±0.85◇△ 1.60 ±0.70◇△

2.1.3 撓頭高峰期 偏頭痛模型組大鼠撓頭高峰期從造模后持續(xù)到90 min，相比之下，鹽酸青藤堿治療組大鼠撓頭高峰期持續(xù)時(shí)間短，僅持續(xù)到造模后60 min，并且高峰期撓頭次數(shù)明顯減少，有顯著性差異(P ＜0.05)，之后各時(shí)段撓頭次數(shù)迅速下降，見圖1。

2.2 各組大鼠PAG 區(qū)NF-κB 和COX-2 陽性細(xì)胞數(shù)的結(jié)果 各組大鼠腦干PAG 區(qū)NF-κB 和COX-2陽性細(xì)胞數(shù)見表3?？瞻讓?duì)照組中NF-κB 和COX-2陽性細(xì)胞數(shù)均很稀少(圖2A、2B)，其中NF-κB陽性細(xì)胞以質(zhì)染形式為主，淡染，未發(fā)生核轉(zhuǎn)位;與空白對(duì)照組相比較，偏頭痛模型組NF-κB 和COX-2 陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖2C、2D)，其中NF-κB 陽性細(xì)胞以核質(zhì)共染形式為主，發(fā)生核轉(zhuǎn)位細(xì)胞增多，染色較深呈棕褐色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與偏頭痛模型組比較，鹽酸青藤堿治療組PAG 區(qū)NF-κB、COX-2 陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖2E、2F)，其中NF-κB 陽性細(xì)胞以核質(zhì)共染和質(zhì)染形式均有，發(fā)生核轉(zhuǎn)位細(xì)胞減少，染色呈棕色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 兩組大鼠撓頭高峰期Fig.1 Peak stage of rats scratching their heads in two groups

表3 各組大鼠PAG 區(qū)NF-κB 和COX-2 陽性細(xì)胞數(shù)(±s，個(gè)/視野)Tab.3 Counts of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (±s，number/field)

表3 各組大鼠PAG 區(qū)NF-κB 和COX-2 陽性細(xì)胞數(shù)(±s，個(gè)/視野)Tab.3 Counts of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (±s，number/field)

注:與空白對(duì)照組比較，◇P ＜0.05;與偏頭痛模型組比較，△P ＜0.05

組別 n NF-κB COX-2空白對(duì)照組10 0.70 ±1.06 0.40 ±0.70偏頭痛模型組 10 17.20 ±3.71◇ 16.10 ±4.38◇鹽酸青藤堿治療組 10 6.10 ±2.42△ 10.70 ±3.30△

圖2 免疫組化法顯示各組大鼠PAG 區(qū)NF-κB 和COX-2 陽性細(xì)胞表達(dá)(×400)Fig.2 Expressions of NF-κB and COX-2 positive cells in the PAG of rats (×400)

2.3 各組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果 各組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)見表4。空白對(duì)照組PAG 區(qū)腦組織5-HT 陽性細(xì)胞分布稀疏，細(xì)胞漿染成棕褐色(圖3A);與空白對(duì)照組相比較，偏頭痛模型組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)無明顯變化(圖3B)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);與偏頭痛模型組比較，鹽酸青藤堿治療組PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖3C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表4 各組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)(±s，個(gè)/視野)Tab.4 Counts of 5-HT positive cells in the PAG of rats(±s，number/field)

表4 各組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)(±s，個(gè)/視野)Tab.4 Counts of 5-HT positive cells in the PAG of rats(±s，number/field)

注:與偏頭痛模型組比較，△P ＞0.05

組別 n 5-HT 陽性細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組10 0.14 ±0.44偏頭痛模型組 10 0.10 ±0.32鹽酸青藤堿治療組 10 14.18 ±2.85△

3 討論

具有痛敏結(jié)構(gòu)的腦膜血管收縮和舒張功能失調(diào)、血管活性肽釋放引起神經(jīng)源性炎癥以及中樞痛覺傳導(dǎo)的抑制降低，是偏頭痛發(fā)作時(shí)主要的病理生理改變［4］。本實(shí)驗(yàn)采用的硝酸甘油偏頭痛大鼠模型，是一種被公認(rèn)為成熟可靠的實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型，通過皮下注射硝酸甘油擴(kuò)張腦血管，產(chǎn)生神經(jīng)源性炎癥，激活三叉神經(jīng)血管復(fù)合體模擬人類偏頭痛發(fā)病過程［5］，造模成功后大鼠出現(xiàn)前肢不停搔頭，煩躁不安等疼痛不適的癥狀，同人類偏頭痛發(fā)作有一定相似之處。既往研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠，神經(jīng)源性炎癥多發(fā)生在三叉神經(jīng)密集分布的硬腦膜血管區(qū)域，表現(xiàn)為NF-κB 陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著增多［6-7］，血漿蛋白滲出，炎癥細(xì)胞因子趨化。NF-κB 作為炎性過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控早期炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的激活，引起神經(jīng)源性炎癥，誘導(dǎo)三叉神經(jīng)致敏，與偏頭痛的發(fā)生密切相關(guān)［8］，COX-2 是被NF-κB 調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物質(zhì)，在偏頭痛發(fā)作時(shí)介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥，促進(jìn)前列腺素生成，上調(diào)痛覺敏感性［9］。有報(bào)道，應(yīng)用氟桂利抑制偏頭痛模型大鼠PAG 內(nèi)NF-κB 表達(dá)，可能是治療偏頭痛的機(jī)制之一［10］，而本實(shí)驗(yàn)在偏頭痛模型組中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)區(qū)，檢測(cè)到表達(dá)NF-κB 和COX-2 陽性神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示該區(qū)域同樣觸發(fā)了神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。提示偏頭痛的發(fā)作可能與PAG 區(qū)內(nèi)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)有著重要的關(guān)系，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖3 免疫組化法顯示各組大鼠PAG 區(qū)5-HT 陽性細(xì)胞表達(dá)(×400)Fig.3 Expression of 5-HT positive cells in the PAG of rats (×400)

研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛模型大鼠PAG 內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)活性的改變及其受體功能的變化，與偏頭痛發(fā)病關(guān)系密切［11］。其中5-HT 是內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)活性物質(zhì)之一，存在于PAG 區(qū)的5-HT 神經(jīng)元細(xì)胞，向下與三叉神經(jīng)核群和脊髓后角聯(lián)系，向上通過丘腦投射到大腦皮質(zhì)感覺中樞，構(gòu)成對(duì)傷害性信息進(jìn)行調(diào)控的抑制通路，生理?xiàng)l件下，機(jī)體受到疼痛刺激后，PAG 區(qū)的5-HT 陽性神經(jīng)細(xì)胞增加，合成的5-HT 通過PAG 內(nèi)復(fù)雜的5-HT 能上下行纖維，積極地參與內(nèi)源性鎮(zhèn)痛過程［12-13］。本實(shí)驗(yàn)造模后大鼠出現(xiàn)偏頭痛樣癥狀，但檢測(cè)到偏頭痛模型組PAG 內(nèi)5-HT 陽性神經(jīng)細(xì)胞，較空白對(duì)照組并沒有明顯增加，提示PAG 內(nèi)5-HT 神經(jīng)細(xì)胞未被激活，未能有效抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)傳入的疼痛信號(hào)導(dǎo)致偏頭痛發(fā)作。這和偏頭痛患者發(fā)作期血漿和腦內(nèi)5-HT 低下的情況相一致［14］。說明偏頭痛模型大鼠PAG 內(nèi)5-HT 神經(jīng)細(xì)胞功能障礙是偏頭痛發(fā)病機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)所用藥物正清風(fēng)痛寧緩釋片除去包衣，其成分即為鹽酸青藤堿［15］，鹽酸青藤堿是一種有效的抗炎鎮(zhèn)痛藥物成分，研究表明其鎮(zhèn)痛部位主要位于中樞［16］，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)觀察到硝酸甘油偏頭痛大鼠在應(yīng)用鹽酸青藤堿治療后，其癥狀行為學(xué)明顯改善，表現(xiàn)為大鼠撓頭次數(shù)和持續(xù)時(shí)間減少，撓頭高峰期降低，與偏頭痛模型組比較有顯著性差異，提示鹽酸青藤堿能有效緩解大鼠偏頭痛樣癥狀。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，鹽酸青藤堿治療組大鼠PAG 內(nèi)5-HT 陽性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)較偏頭痛模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)PAG 區(qū)表達(dá)NF-κB 和COX-2 陽性神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，與偏頭痛模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)分析，鹽酸青藤堿在PAG 可能的鎮(zhèn)痛機(jī)制有:1. 直接抑制PAG 區(qū)神經(jīng)源性炎癥，通過抑制神經(jīng)細(xì)胞NF-κB 表達(dá)，下調(diào)COX-2活性，減少前列腺素生成達(dá)到鎮(zhèn)痛效果［16］。2. 上調(diào)偏頭痛發(fā)作時(shí)PAG 區(qū)5-HT 表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［17］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，特異性5-HT 受體激動(dòng)劑可以通過抑制NF-κB 活化，減輕腦膜神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，抑制血管擴(kuò)張，達(dá)到緩解偏頭痛的作用［18］。提示鹽酸青藤堿也可能通過上調(diào)5-HT 合成，激活5-HT 受體，減輕PAG 區(qū)的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)這條路徑而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。

綜上，推測(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)發(fā)生神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)和5-HT 能神經(jīng)細(xì)胞功能低下，可能是偏頭痛發(fā)病的重要機(jī)制。而鹽酸青藤堿可能通過多種途徑，抑制偏頭痛模型大鼠PAG 區(qū)的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，上調(diào)5-HT 合成水平，達(dá)到緩解偏頭痛發(fā)作的作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論也為偏頭痛的神經(jīng)源性抗炎治療提供了一定的理論依據(jù)。

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