左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4、Cx43 的影響

王宇紅， 譚小雯， 曾 嶸， 柴 上， 楊 蕙， 孟 盼， 張秀麗

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007;2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙410007;3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007)

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂癥，并且抑郁癥已被確認(rèn)為糖尿病又一并發(fā)癥。在我國約有51%的糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥［1］。目前，糖尿病并發(fā)抑郁癥的研究多集中于臨床，對(duì)于血腦屏障的研究鮮有報(bào)道，且實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象多以海馬神經(jīng)元為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病能破壞血腦屏障［2］，而修復(fù)損傷的血腦屏障對(duì)于保護(hù)神經(jīng)元有積極作用［3］。血腦屏障是由四個(gè)部分組成:毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間緊密連接，內(nèi)皮基膜，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足和周細(xì)胞。水通道蛋白AQP4、縫隙連接蛋白Cx43 表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上，構(gòu)成了血腦屏障的精細(xì)結(jié)構(gòu)［4-5］，對(duì)維持血腦屏障內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要意義。以AQP4、Cx43 為標(biāo)志的血腦屏障損傷是否參與了糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)生發(fā)展，還未見報(bào)道。左歸降糖解郁方是以張仲景的古方左歸飲、左歸丸化裁而得的左歸降糖方為基本方，再加入行氣活血、疏肝解郁的姜黃、貫葉金絲桃組成的“左歸降糖解郁方”［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)研究左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4、Cx43 的影響，不但對(duì)深入了解糖尿病并發(fā)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有重要意義，而且為開發(fā)新藥提供了新的思路。

1 材料與儀器

1.1 藥品 左歸降糖解郁方的組成藥物為黃芪18 g、貫葉連翹3 g、姜黃9 g、熟地黃15 g、山茱萸12 g、枸杞12 g、菟絲子9 g、杜仲9 g、丹參12 g、丹皮6 g、牛膝9 g，原材料購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。鹽酸二甲雙胍片(規(guī)格0.25 g，批號(hào)1402115，湖南湘雅制藥有限公司);百憂解(鹽酸氟西汀膠囊，20 mg，批號(hào)2087A，法國Patheon)。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ) (美國Sigma 公司);兔抗大鼠AQP4、Cx43 多克隆抗體(武漢博士德有限公司);高脂乳劑組成:10% 膽固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%豬油、2%膽酸鈉、20%聚山梨酯80、20%丙二醇，加蒸餾水至100 mL。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180 ～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK (湘)2013-0004;合格證號(hào)43004700004535。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，動(dòng)物自由攝食與飲水。

1.4 儀器 One Touch Ⅱ血糖儀及血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)，動(dòng)物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)(法國Viewpoint 公司)，Olympus 生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，DVP-W7 顯微鏡圖像處理系統(tǒng)(南京長(zhǎng)城信息系統(tǒng)公司)，RM223 切片機(jī)(德國萊卡公司)。

2 方法

2.1 糖尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型的制備［7-8］SD大鼠以高脂乳劑10 mL/kg 連續(xù)灌胃14 d，每天1次，末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，一次性尾靜脈注射STZ (溶于新鮮配制的0.1 mol/L、pH 4.5 枸櫞酸緩沖液中，4 ℃保存)38 mg/kg，空白組大鼠1 次性尾靜脈注射0.1 mol/L、pH 4.5 枸櫞酸緩沖液，體積為2 mL/kg。造模3 d 后，大鼠禁食不禁水6 h，測(cè)定空腹血糖，從中選取空腹血糖≥16.00 mmol/L 的大鼠為糖尿病模型。繼續(xù)給予糖尿病模型動(dòng)物慢性應(yīng)激，具體包括4 ℃冰水浴5 min、45 ℃熱刺激5 min、傾籠45° 24 h、噪音8 h、晝夜顛倒24 h、潮濕墊料(200 mL/籠，24 h)、夾尾1 min，每天采用1 種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，共刺激28 d。成模后，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠空腹血糖始終≥16.00 mmol/L，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能紊亂致血漿皮質(zhì)酮的量升高，Open-field 實(shí)驗(yàn)中大鼠水平活動(dòng)及垂直活動(dòng)減少，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)。

2.2 分組與給藥 50 只造模大鼠隨機(jī)分為5 組:模型組，陽性藥(二甲雙胍0.18 g/kg +鹽酸氟西汀1.8 mg/kg)組，左歸降糖解郁方高、中、低劑量(32.82、16.41、8.20 g/kg)組。另取10 只SD 大鼠作為空白組。各組大鼠于造模同時(shí)灌胃給藥，共28 d，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。

2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮操作系統(tǒng):直徑為1.5 m 的圓形水池，平臺(tái)直徑為0.15 m，水深0.4 m，平臺(tái)置于迷宮西南象限。水面高出平臺(tái)3 cm，水溫保持(24 ±1)℃。

給藥后，對(duì)6 組大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練5 d，記錄逃避潛伏期，考查學(xué)習(xí)能力。

2.4 樣本采集 大鼠麻醉后左心室灌注生理鹽水，剪開右心耳，以便將腦血管內(nèi)的血液沖出。待流出液澄清后，4%多聚甲醛灌注固定1 h，取全腦，放入4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，一部分常規(guī)HE 染色，另一部分免疫組化監(jiān)測(cè)。

2.5 海馬組織病理學(xué)檢測(cè) 常規(guī)石蠟包埋切片后，4 μm 連續(xù)切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察海馬組織病理學(xué)改變并比較。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)AQP4、Cx43 的表達(dá) 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。操作如下:上述石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用新鮮配置3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBS 洗3 次各5 min。將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，微波加熱至沸騰后斷電，待自然冷卻后，PBS 洗2 次各5 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min。甩去多余液體。分別滴加兔抗大鼠AQP4、Cx43 I抗50 μL，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫45 min，PBS 洗3次各5 min。滴加II 抗50 μL，室溫孵育30 min，PBS 洗3 次各5 min。滴加SABC，室溫孵育30 min PBS 洗3 次各5 min。DAB 顯色，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間5 ～10 min，自來水沖洗10 min。蘇木精輕度復(fù)染2 min，最后脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察每張玻片海馬部位AQP4、Cx43 的表達(dá)情況，陽性細(xì)胞為棕褐色。觀察3 個(gè)不同的視野，計(jì)算積分光密度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0，所有計(jì)量資料以±s 表示，組間采用單因素方差分析 (One-way-ANOVA)，t 檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有顯著意義(P ＜0.01)。與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，差異有顯著意義(P ＜0.01)，提示陽性藥和左歸降糖解郁方高劑量能顯著改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠空間學(xué)習(xí)能力。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期情況(±s，n=10)Tab.1 Rats’escape latency in each group (±s，n=10)

表1 各組大鼠逃避潛伏期情況(±s，n=10)Tab.1 Rats’escape latency in each group (±s，n=10)

注:與空白組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量 逃避潛伏期/s空白組22.50 ±17.55模型組 80.80 ±18.12＊＊陽性藥組 二甲雙胍0.18 g/kg+鹽酸氟西汀1.8 mg/kg 27.18 ±23.57##左歸降糖解郁方高劑量組 32.82 g/kg 33.00 ±21.79##左歸降糖解郁方中劑量組 16.41 g/kg 58.00 ±33.37左歸降糖解郁方低劑量組8.20 g/kg 76.70 ±21.78

3.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)比較 空白組大鼠海馬椎體細(xì)胞形態(tài)正常，排列正常。與空白組比較，模型組大鼠海馬椎體細(xì)胞存在損傷，表現(xiàn)為錐體細(xì)胞胞體固縮，深染及空泡變性。與模型組比較，陽性藥和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠海馬細(xì)胞空泡細(xì)胞數(shù)量減少，少見細(xì)胞腫脹;而左歸降糖解郁方中劑量組和低劑量對(duì)海馬細(xì)胞形態(tài)損傷改善能力較弱。結(jié)果見圖1。

3.3 各組大鼠海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4 表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠AQP4 積分光密度值減少，提示AQP4 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方高劑量組AQP4 積分光密度值增加，提示AQP4 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。結(jié)果見表2，圖2。

3.4 各組大鼠海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)Cx43 表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠Cx43 積分光密度值減少，提示Cx43 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方高劑量組Cx43 積分光密度值增加，提示Cx43 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果見表3，圖3。

圖1 各組海馬組織HE 染色結(jié)果(×400)Fig.1 Images of hippocampal HE staining in each group (×400)

表2 各組大鼠海馬AQP4 免疫陽性積分光密度值比較(±s，n=10)Tab.2 Comparison of AQP4 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

表2 各組大鼠海馬AQP4 免疫陽性積分光密度值比較(±s，n=10)Tab.2 Comparison of AQP4 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

注:與空白組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別劑量 積分光密度值空白組1.89 ±0.99模型組 - 0.38 ±0.26*陽性藥組 二甲雙胍0.18 g/kg+鹽酸氟西汀1.8 mg/kg 1.40 ±0.39#左歸降糖解郁方高劑量組 32.82 g/kg 1.13 ±0.50#左歸降糖解郁方中劑量組 16.41 g/kg 0.48 ±0.14左歸降糖解郁方低劑量組-8.20 g/kg 0.44 ±0.13

圖2 各組海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4 免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.2 Images of AQP4 immunohistochemical staining in hippocampal BBB’s fine structure in each group (×400)

表3 各組大鼠海馬Cx43 免疫陽性積分光密度值比較(±s，n=10)Tab.3 Comparison of Cx43 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

表3 各組大鼠海馬Cx43 免疫陽性積分光密度值比較(±s，n=10)Tab.3 Comparison of Cx43 immunoreactive integrated optical density value of rats’hippocampus in each group (±s，n=10)

注:與空白組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別劑量 積分光密度值空白組1.46 ±0.64模型組 - 0.46 ±0.03*陽性藥組 二甲雙胍0.18 g/kg+鹽酸氟西汀1.8 mg/kg 0.96 ±0.27#左歸降糖解郁方高劑量組 32.82 g/kg 0.75 ±0.21#左歸降糖解郁方中劑量組 16.41 g/kg 0.53 ±0.46左歸降糖解郁方低劑量組-8.20 g/kg 0.43 ±0.34

圖3 各組海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)Cx43 免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.3 Images of Cx43 immunohistochemical staining in hippocampal BBB’s fine structure in each group (×400)

4 討論

高脂乳劑灌胃、尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，38 mg/kg)、28 d 慢性應(yīng)激聯(lián)合的方法可成功復(fù)制糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型。本課題組前期研究表明［7］應(yīng)用該造模方法后，大鼠空腹血糖始終≥16.00 mmol/L，HPA 軸功能紊亂，行為學(xué)上出現(xiàn)自主活動(dòng)度降低、對(duì)新鮮環(huán)境好奇度降低及嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，可從生理和心理雙重角度模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥臨床發(fā)病過程。

血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的重要結(jié)構(gòu)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定依賴血腦屏障功能完整。AQP4、Cx43 表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上，構(gòu)成了血腦屏障的精細(xì)結(jié)構(gòu)，對(duì)維持血腦屏障內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要意義。

水通道蛋白是一類介導(dǎo)跨膜水運(yùn)輸?shù)膬?nèi)在蛋白，AQP4 主要于神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜和胞漿高度表達(dá)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞外間隙中水和K+的濃度［9］，對(duì)于維持中樞內(nèi)環(huán)境平衡有著舉足輕重的地位。文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病大鼠血腦屏障損傷，電鏡下可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足存在明顯水腫［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠AQP4 表達(dá)減少。而與模型組大鼠相比，陽性藥 (二甲雙胍0.18 g/kg + 鹽酸氟西汀1.8 mg/kg)組與左歸降糖解郁方高劑量組大鼠AQP4表達(dá)增加。因此，我們推測(cè)AQP4 的減少使水分子滯留于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹。左歸降糖解郁方通過調(diào)控AQP4 的表達(dá)，維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，可能成為潛在的治療機(jī)制之一。

縫隙連接蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞間進(jìn)行信息和物質(zhì)交流的基礎(chǔ)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞終足間存在大量縫隙連接，其中Cx43 是主要的縫隙連接蛋白［5］。有研究認(rèn)為Cx43 是維持血腦屏障完整性必需的，表達(dá)減少可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞足突水腫，血腦屏障功能下降［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠Cx43 表達(dá)減少。而與模型組大鼠相比，陽性藥組與左歸降糖解郁方高劑量組大鼠Cx43 表達(dá)增加。因此，我們推測(cè)Cx43的減少使血腦屏障完整性被破壞，與AQP4 的量變化共同加劇了中樞內(nèi)環(huán)境紊亂及血腦屏障損傷。

本實(shí)驗(yàn)光鏡下，HE 染色可見模型組大鼠海馬存在損傷，左歸降糖解郁方高劑量可對(duì)損傷的海馬細(xì)胞產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。Morris 水迷宮測(cè)試行為學(xué)的結(jié)果表明糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠存在嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，而左歸降糖解郁方能改善其認(rèn)知功能。結(jié)合AQP4、Cx43 免疫組織化學(xué)的結(jié)果，我們推測(cè)左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的治療作用可能與調(diào)控海馬血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4、Cx43 表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)給予糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠左歸降糖解郁方干預(yù)后，大鼠血腦屏障精細(xì)結(jié)構(gòu)AQP4、Cx43 表達(dá)紊亂的情況得到緩解，可能為治療糖尿病并發(fā)抑郁癥開辟新的思路。

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