活血通腑方對(duì)術(shù)后腹腔粘連大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1 及CD40/CD40L的影響

曾 莉， 顏 帥， 李文林， 毛春芹， 宗 陽(yáng)， 寧子琬， 楊 斕

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210023;2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)圖書(shū)館，江蘇 南京210023;3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023)

術(shù)后腹腔粘連(Postoperative Peritoneal Adhesion，PPA)是指盆、腹腔外科術(shù)后因腹膜損傷后形成處于分離狀態(tài)的腹腔臟器或與腹壁間的異常纖維帶，該病除發(fā)病率較高，可引起諸如慢性疼痛、機(jī)械性腸梗阻、女性不孕以及增加二次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者精神和經(jīng)濟(jì)上帶來(lái)雙重負(fù)擔(dān)［1-2］。如何避免或減少術(shù)后腹腔粘連的發(fā)生，是外科學(xué)者們一直以來(lái)研究的熱點(diǎn)。近年有文獻(xiàn)表明，手術(shù)和外傷深刻地影響著機(jī)體先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)［3］，但既往的研究工作雖提出免疫因素參與并啟動(dòng)腹腔粘連的過(guò)程，但是對(duì)術(shù)后腹膜損傷激活免疫的觸發(fā)點(diǎn)研究涉及較少。雖眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)通路如以調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1 為主體的Smad通路［4］、以調(diào)控腫瘤壞死因子TNF-α 為中心的NFκB 通路、JAK/STAT 通路［5-6］，以影響纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)為主體的RhoA/ROCK-MAPK 通路［7］。眾多信號(hào)途徑與術(shù)后粘連的病程有關(guān)，然而不同信號(hào)通路有沒(méi)有一個(gè)共同的觸發(fā)點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此課題組對(duì)影響腹腔粘連的進(jìn)展進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

腹腔粘連與炎癥和免疫密不可分，手術(shù)和創(chuàng)傷不僅僅是對(duì)機(jī)體造成炎癥損害，炎癥細(xì)胞的過(guò)度激活以及炎癥介質(zhì)的大量釋放，一定程度上影響機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)［3］。既往國(guó)外對(duì)免疫因素在腹腔粘連中的研究多集中在整體動(dòng)物模型水平，目的細(xì)胞集中在肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群等，尚未見(jiàn)有關(guān)免疫指標(biāo)在血及粘連組織中的測(cè)定。炎癥反應(yīng)不僅僅存在于腹部術(shù)后早期，在術(shù)后粘連形成過(guò)程中一直存在［8-9］。CD40/CD40L 是機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)中的一條重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和放大中起著重要作用，在免疫平衡的調(diào)節(jié)中不可或缺［10］。

課題組前期在臨床療效觀察基礎(chǔ)上，從整體動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn)，活血通腑方能下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連大鼠術(shù)后血漿纖維蛋白原［11-12］、TGF-β mRNA［13］表達(dá)水平，防治粘連效果確切。鑒于CD40/CD40L 位于細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，該信號(hào)通路的激活是使炎癥反應(yīng)逐步放大的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)研究活血通腑方對(duì)術(shù)后腹腔粘連大鼠MCP-1 趨化因子及CD40/CD40L 信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)在術(shù)后腹腔粘連的發(fā)病過(guò)程中的作用，驗(yàn)證活血通腑方是否是通過(guò)調(diào)控CD40/CD40L 系統(tǒng)從而促進(jìn)恢復(fù)機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而為活血通腑方在防治術(shù)后腹腔粘連的應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 活血通腑方組成:大黃、桃仁、芒硝、延胡索、萊菔子、紅花，購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)炮制實(shí)驗(yàn)室陸兔林教授鑒定為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合要求的道地藥材。相關(guān)樣品液的制備方法參照文獻(xiàn)［14］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行放大，共計(jì)350 副(包括含藥血清實(shí)驗(yàn))中藥，取所得浸膏濃縮至相對(duì)密度1.12 ～1.15(60 ℃)，放置于4 ℃冰箱備用。四磨湯口服液:每瓶含生藥4.6 g，湖南漢森制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字130632235。

1.2 動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠150 只，體質(zhì)量220 ～250 g，由江蘇大學(xué)動(dòng)物中心提供(清潔級(jí))，合格證號(hào)SCXK-(蘇)2013-0011。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》［15］的規(guī)定。大鼠實(shí)驗(yàn)前于動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境5 d，自由采食和飲水，室溫18 ～25 ℃，相對(duì)濕度65% ～70%，照明晝夜明暗交替。

1.3 試劑 10%水合氯醛麻醉劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);CD40，CD40L (美國(guó)eBioscience公司)和MCP-1 單克隆抗體 (美國(guó)Millipore 公司);ElivisionTMsuper 免疫組化檢測(cè)試劑盒(福建邁新生物技術(shù)有限公司);DEPC 水(GENERAY Biotechnology 公司);PBS 緩沖液(自行配制);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器 流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Counter 公司FC500 型;Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics. Inc);EDTA 抗凝管(奧地利格雷那公司);什錦銼刀(上海力易得工具有限公司);Leica ASP300S 全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica 公司);Thermo 包埋機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，型號(hào)Histostar);Thermo 手動(dòng)切片機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，型號(hào)Finesse E);Shandon 全自動(dòng)染色機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);OLYMPUS 顯微鏡BX41(日本Olympus 公司)。

1.5 方法 參考文獻(xiàn)［14］，將180 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，活血通腑方低、中、高劑量組，四磨湯組6 組，每組6 只。造模前各組大鼠禁食12 h，不禁水。用10% 水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/kg)麻醉，動(dòng)物麻醉后仰臥位固定，腹部剪毛、消毒后，無(wú)菌操作下取前正中切口2 cm進(jìn)腹;除假手術(shù)組外，其余各組回盲部右側(cè)面用什錦銼刀反復(fù)磨擦漿膜層至表面針尖狀出血點(diǎn)，形成約5 cm × 4 cm 的受損創(chuàng)面后納入腹腔，假手術(shù)組大鼠，用無(wú)齒鑷鉗夾將回盲部腸管拉出腹腔外，充分暴露3 min 后復(fù)位，各組逐層關(guān)腹，分籠飼養(yǎng)。每只大鼠從造模開(kāi)始到關(guān)腹，時(shí)間控制在5 min，術(shù)中各項(xiàng)生命體征平穩(wěn)。造模后6 h，活血通腑方低、中、高劑量組造模大鼠按體表面積換算后，分別給予活血通腑方2、6、18 g/kg 藥液灌胃，四磨湯組給予5.40 g/kg 口服液灌胃，灌胃藥液溫度均控制在38 ℃左右。假手術(shù)組和模型組均予等容量生理鹽水灌胃，1 次/d，共14 d。

1.5.1 肉眼腹腔粘連和鏡下病理評(píng)分 分別于術(shù)后1、3、5、7、14 d 每組隨機(jī)各取6 只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，劍突下“U”型切口進(jìn)腹，分別從粘連數(shù)目、粘連范圍、粘連強(qiáng)度五分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察粘連情況，由第三方分別記錄粘連得分;取處死大鼠腸創(chuàng)面處粘連組織，10%福爾馬林溶液固定，石臘包埋切片，HE 染色，鏡檢病理改變，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師(未參與實(shí)驗(yàn))進(jìn)行評(píng)分。肉眼腹腔粘連評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［16-17］和鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［18］分別見(jiàn)表1 和表2。

表1 肉眼腹腔粘連分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Macroscopic peritoneal adhesion grading standard

表2 鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Pathological grading standard

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD40、CD40L 水平各組大鼠分別在1、3、5、7、14 d 眼球取血，EDTA 抗凝收集，取100 μL 的抗凝血移置EP 管中，紅細(xì)胞裂解液復(fù)溫后，各EP 管加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液，室溫下裂解10 min，然后PBS 分別清洗;其中CD40L 組EP 管先后加入含有5 μL Rb pAb to CD40L (abcam)和10 μL Dnk pAb to Rb IgG(Alexa Fluor@647)的離心管中震勻，于4 ℃下保存30 min 以孵育抗體。PBS 清洗各組EP 管，以300 ×g 常溫離心機(jī)離心5 min，棄上清。CD40 組各管中分別加入40 μL Anti-Mouse/Rat CD40 FITC(eBioscience Inc. San Diego，CA)，用旋渦混合儀(XW-80A)將EP 管震勻，4 ℃下避光孵育30 min。Eppendorf 離心機(jī)300 ×g 離心5 min 后，棄上清。適量PBS 同上進(jìn)行離心，反復(fù)幾次，以試管底部不見(jiàn)紅色為度，過(guò)濾后定容至900 μL 后，移至流式管上機(jī)待測(cè)。

1.5.3 免疫組化檢測(cè)粘連組織中CD40、CD40L、MCP-1 蛋白表達(dá)水平 斷椎處死大鼠，剪取粘連組織(假手術(shù)組無(wú)粘連形成，均取相同部位盲腸組織)置于4%多聚甲醛固定。各樣本經(jīng)脫水、石蠟包埋后做成厚約4 μm 切片。之后行ENVISION 法染色檢測(cè)CD40、CD40L、MCP-1 在大鼠腸組織的表達(dá)情況。步驟如下:石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫封閉10 min，抗原修復(fù)，滴加50 μL 聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，PBS洗兩次。滴加50 μL 酶標(biāo)抗兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，再次PBS 沖洗兩次。每張切片滴加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察1 ～3 min，陽(yáng)性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5 個(gè)高倍視野拍照，用Image Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件，進(jìn)行半定量分析，測(cè)定各組積分光密度值(IOD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean ±SD 表示，肉眼和鏡下評(píng)分因呈非正態(tài)分布，故采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間差異性比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊性采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 術(shù)后各組大鼠未出現(xiàn)死亡，腹部切口愈合良好，無(wú)滲出、紅腫和切口疝發(fā)生。術(shù)后24 h，各組大鼠一般情況均差，不活動(dòng)，少量進(jìn)食、飲水。術(shù)后2 d，一般狀態(tài)尚可，活動(dòng)量較前增加，進(jìn)食和飲水基本恢復(fù)正常。術(shù)后第3 天起，體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，腹部創(chuàng)面縫線逐漸脫落，活動(dòng)恢復(fù)正常，進(jìn)食和水量正常。各組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間逐漸增加，活血通腑方各組和四磨湯組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)與假手術(shù)和模型組相比較緩慢，但各組間相比統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異。

2.2 各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腹腔粘連分級(jí)評(píng)分 如圖1 所示，在術(shù)后第1 天，除假手術(shù)組外，其余各組均見(jiàn)粘連形成，尤以模型組明顯(1.17 ±0.39)。模型組第3 天和第5 天，粘連范圍局限，粘連程度疏松，多呈膜狀粘連，各治療組可不同程度降低肉眼腹腔粘連評(píng)分。術(shù)后第7 天模型組，粘連范圍增大，韌性較前有所增加，部分粘連偶見(jiàn)伴生血管?；钛ǜ降汀⒏邉┝拷M和四磨湯組見(jiàn)粘連數(shù)目減少，疏松，未見(jiàn)血管生成。術(shù)后第14 天，粘連范圍和第7 天相比有所擴(kuò)大，韌性無(wú)明顯差異，粘連評(píng)分為(5.60 ±0.75)。各治療組和模型組相比較，不同程度改善腹腔粘連程度，其中活血通腑方高劑量組腹腔粘連評(píng)分存在顯著性差異(P ＜0.01)。術(shù)后第3 天和術(shù)后第5 天，術(shù)后第7 天和第14 天相比，除模型組和活血通腑方高劑量組以外，其余各組粘連評(píng)分無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 各組各時(shí)間點(diǎn)腹腔粘連級(jí)別評(píng)分Fig.1 Each time point of peritoneal adhesion scores of groups

2.3 各組大鼠病理?yè)p傷評(píng)分 由圖2 可知，術(shù)后第1 天，與假手術(shù)組和各治療組，模型組ICR 和IF 評(píng)分顯著增多。術(shù)后第3 天，各組主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞不同程度的浸潤(rùn)，組織水腫。術(shù)后第5天，鏡下表現(xiàn)以炎性反應(yīng)為主。術(shù)后第7 天，各組主要表現(xiàn)為慢性炎癥和纖維增生，鏡下可見(jiàn)梭形平滑肌樣細(xì)胞。與模型組相比，活血通腑方組和四磨湯組均能降低鏡下評(píng)分，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)?；钛ǜ降?、中、高劑量組與四磨湯組相比，活血通腑方高劑量組具有顯著意義(P ＜0.01)。從表3 可以得出，除假手術(shù)組外，術(shù)后第1、7、14 天各組間ICR 評(píng)分相比無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，而術(shù)后第7、14 天同組間相比亦無(wú)明顯差異。術(shù)后第1、3、5、7 天活血通腑高劑量組能不同程度降低鏡下炎癥評(píng)分，術(shù)后第14 天不明顯(P ＜0.05)。表明術(shù)后第1、3、5、7 天活血通腑高劑量組能減輕粘連部位的炎癥反應(yīng)。從表4 可以得出，第1、5、14 天各組與模型組相比IF 評(píng)分無(wú)顯著性差異，術(shù)后第3、7 天各組與模型組相比，IF 評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，假手術(shù)組除外。提示術(shù)后第3、7 天活血通腑方各組能降低粘連部位的IF 評(píng)分。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)ICR 評(píng)分(±s，n=6)Tab.3 Scores in inflammatory cell reaction at time point of groups (±s，n=6)

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)ICR 評(píng)分(±s，n=6)Tab.3 Scores in inflammatory cell reaction at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 2.80 ±0.13 1.67 ±0.38 1.53 ±0.21 0.67 ±0.47 0.33 ±0.27活血通腑方低劑量組 2.60 ±0.16 1.44 ±0.40 0.97 ±0.33 0.75 ±0.68 0.59 ±0.55活血通腑方中劑量組 2.30 ±0.15 1.24 ±0.61 0.87 ±0.13 0.66 ±0.29 0.36 ±0.30活血通腑方高劑量組 2.2 ±0.13* 0.90 ±0.50* 0.72 ±0.26* 0.58 ±0.31* 0.41 ±0.40四磨湯 2.40 ±0.16 1.39 ±0.92 1.03 ±0.19 0.97 ±0.48 0.6 4 ±0.50

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)IF 評(píng)分(±s，n=6)Tab.4 Scores in interstitial fibrosis at time point of groups (±s，n=6)

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)IF 評(píng)分(±s，n=6)Tab.4 Scores in interstitial fibrosis at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 1.33 ±0.29 1.16 ±0.21 1.09 ±0.23 1.11 ±0.37 1.16 ±0.55活血通腑方低劑量組 0.94 ±0.40 0.90 ±0.32* 0.96 ±0.25 0.81 ±0.63* 0.87 ±0.43活血通腑方中劑量組 0.62 ±0.31 0.71 ±0.28* 0.77 ±0.30 0.66 ±0.29* 0.75 ±0.39活血通腑方高劑量組 0.65 ±0.29 0.57 ±0.17＊＊ 0.53 ±0.19 0.48 ±0.36＊＊ 0.59 ±0.54四磨湯 0.74 ±0.36 0.86 ±0.19 1.01 ±0.27 0.89 ±0.28*0.85 ±0.38

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)典型病理切片F(xiàn)ig.2 Typical microscopic section at time point of groups

2.4 各組不同時(shí)間在單核細(xì)胞CD40、CD40L 表達(dá)水平 經(jīng)紅細(xì)胞裂解液后，流式檢測(cè)外周血細(xì)胞分群良好，在單核細(xì)胞群上CD40、CD40L 表達(dá)差異顯著。從表5 和表6 可知，與假手術(shù)組相比，模型組分別在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)單核細(xì)胞CD40、CD40L 的表達(dá)升高明顯(P ＜0.01)?；钛ǜ礁鹘M在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)能不同程度降低單核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)水平(P ＜0.05)，尤以活血通腑高劑量組明顯(P ＜0.01)。四磨湯組僅在術(shù)后第1 天單核細(xì)胞CD40 表達(dá)水平與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，但在不同時(shí)間點(diǎn)卻能不同程度降低單核細(xì)胞CD40L 的表達(dá)水平(P ＜0.05)。

表5 各組不同時(shí)間單核細(xì)胞CD40 表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.5 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40 at time points of groups (±s，n=6)

表5 各組不同時(shí)間單核細(xì)胞CD40 表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.5 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40 at time points of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 20.02 ±5.07 16.78 ±5.12 14.58 ±2.42 13.28 ±1.519.94 ±0.47模型組 45.65 ±5.32 35.86 ±2.13 33.17 ±2.95 32.09 ±4.42 29.25 ±4.55活血通腑方低劑量 37.90 ±8.37* 29.64 ±5.22* 29.10 ±2.68* 25.38 ±6.37* 20.24 ±5.01*活血通腑方中劑量 34.73 ±6.65* 27.30 ±4.71* 24.37 ±3.61* 22.11 ±4.12* 18.34 ±3.32*活血通腑方高劑量 30.51 ±4.57＊＊ 24.28 ±5.04＊＊ 21.69 ±2.86＊＊ 19.89 ±0.31＊＊ 15.65 ±2.72＊＊四磨湯 38.03 ±6.70* 35.23 ±4.06 32.38 ±4.63 28.02 ±2.59 25.20 ±1.99

表6 各組單核細(xì)胞CD40L 表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.6 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40L at time point of groups (±s，n=6)

表6 各組單核細(xì)胞CD40L 表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.6 Comparison between the expressions of mononuclear cell CD40L at time point of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 1.82 ±0.08 0.8 ±0.05 0.67 ±0.04 0.48 ±0.09 0.28±0.02模型組 18.73 ±0.67 10.34 ±3.11 8.56 ±1.96 6.47 ±2.04 3.39 ±0.56活血通腑方低劑量 4.67 ±2.11* 1.95 ±0.94* 0.92 ±0.29* 0.79 ±0.15* 0.65 ±0.06*活血通腑方中劑量 4.43 ±3.09* 1.63 ±0.77* 0.80 ±0.18* 0.75 ±0.11* 0.54 ±0.06*活血通腑方高劑量 4.07 ±0.64＊＊ 1.41 ±0.24＊＊ 0.74 ±0.25＊＊ 0.61 ±0.02＊＊ 0.38 ±0.04＊＊四磨湯 5.56 ±2.26* 1.79 ±0.42* 1.2 ±0.15* 0.83 ±0.09* 0.67 ±0.02*

2.5 各組粘連組織中CD40、CD40L、MCP-1 蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平 與假手術(shù)相比，各時(shí)間點(diǎn)PA 模型組CD40、CD40L 水平顯著增加;與模型組相比，四磨湯組在不同時(shí)間點(diǎn)不同程度降低CD40、CD40L 水平，以術(shù)后第1、14 天明顯;活血通腑方各組呈劑量依賴性降低CD40、CD40L 水平，尤以活血通腑方高劑量組顯著(P ＜0.01)。同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)相比，CD40、CD40L 水平僅在術(shù)后第1 天和術(shù)后第14 天相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，在術(shù)后第3、5 和7 天無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。各組MCP-1 蛋白水平與模型組相比亦隨時(shí)間的推移逐漸降低，同一時(shí)間點(diǎn)不同組相比，以活血通腑方中、高劑量組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);而同組不同時(shí)間點(diǎn)相比術(shù)后第1、3、14 天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖3 ～4 和表7 ～9。

圖3 各組不同時(shí)間粘連組織CD40 蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expressions of CD40 protein in tissue adhesion at time point of groups

圖4 各組不同時(shí)間粘連組織CD40L 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Comparison between the expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups

表7 各組粘連組織CD40 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.7 Comparison between the expressions of CD40 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表7 各組粘連組織CD40 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.7 Comparison between the expressions of CD40 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 27.51 ±12.30 26.03 ±13.65 25.76 ±11.80 23.52 ±11.81 14.95 ±11.24模型組 126.04 ±16.27 120.41 ±16.69 115.16 ±17.94 115.99 ±14.04 100.22 ±13.12活血通腑方低劑量 90.72 ±15.52* 90.29 ±18.27* 86.85 ±15.51* 85.01 ±13.22* 66.83 ±16.46*活血通腑方中劑量 56.93 ±12.07＊＊ 55.30 ±11.71＊＊ 52.47 ±13.26＊＊ 48.11 ±13.08＊＊ 38.53 ±12.93＊＊活血通腑方高劑量 44.11 ±12.43＊＊ 42.76 ±11.98＊＊ 42.14 ±11.34＊＊ 40.14 ±13.87＊＊ 26.89 ±10.95＊＊四磨湯 65.71 ±11.40* 64.03 ±13.87* 61.58 ±11.25* 58.41 ±12.29* 46.62 ±12.70*

表8 各組粘連組織CD40L 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.8 Comparison between expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表8 各組粘連組織CD40L 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.8 Comparison between expressions of CD40L protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 27.38 ±10.50 27.61 ±10.41 26.58 ±11.18 23.76 ±11.11 21.37 ±11.08模型組 126.88 ±10.98 113.30 ±15.45 112.84 ±16.13 108.35 ±16.20 101.19 ±17.85活血通腑方低劑量 96.09 ±14.32* 90.37 ±11.34* 87.42 ±14.82* 85.65 ±10.74* 81.50 ±12.56*活血通腑方中劑量 59.44 ±12.13＊＊ 57.29 ±13.68＊＊ 54.97 ±11.47＊＊ 50.61 ±12.18＊＊ 49.85 ±11.42＊＊活血通腑方高劑量 50.48 ±11.60＊＊ 46.13 ±11.91＊＊ 42.81 ±15.04＊＊ 41.78 ±13.80＊＊ 40.20 ±12.38＊＊四磨湯 72.27 ±12.60* 71.95 ±11.23* 68.30 ±11.66* 57.04 ±14.94* 56.17 ±10.25*

表9 各組粘連組織MCP-1 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.9 Comparison between expressions of MCP-1 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

表9 各組粘連組織MCP-1 蛋白表達(dá)比較(±s，n=6)Tab.9 Comparison between expressions of MCP-1 protein in tissue adhesion of groups (±s，n=6)

注:與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別1 d 3 d 5 d 7 d 14 d假手術(shù)組 33.10 ±13.96 29.39 ±12.85 28.92 ±11.55 22.62 ±15.13 19.72 ±12.14模型組 123.46 ±16.64 110.50 ±12.85 110.16 ±15.78 109.27 ±17.49 104.83 ±12.78活血通腑方低劑量 93.80 ±14.17* 91.23 ±11.31* 90.37 ±12.71* 86.94 ±14.44* 85.78 ±18.50*活血通腑方中劑量 72.34 ±13.51＊＊ 69.54 ±12.98＊＊ 62.11 ±13.22＊＊ 58.64 ±13.91＊＊ 51.66 ±12.28＊＊活血通腑方高劑量 65.54 ±13.86＊＊ 48.25 ±14.24＊＊ 46.11 ±11.99＊＊ 45.72 ±12.52＊＊ 39.86 ±13.74＊＊四磨湯 80.15 ±102.44* 74.40 ±13.37* 63.73 ±15.20* 61.61 ±12.04* 60.18 ±13.86*

3 討論

CD40/CD40L 是一對(duì)互補(bǔ)跨膜糖蛋白，兩者通過(guò)結(jié)合而發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)，該信號(hào)通路是機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)中的一條重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫平衡的調(diào)節(jié)中不可或缺［19］。CD40 是分子量為48 ～50 kD 表達(dá)于細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，常表達(dá)于B 細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞［20］，亦結(jié)構(gòu)性表達(dá)于腹膜間皮細(xì)胞［21］。CD40L 是分子量為39 kD 的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于CD4+T 細(xì)胞表面，亦表達(dá)于單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NK 細(xì)胞表面［22］。雖然二者分別表達(dá)于不同細(xì)胞，但CD40L 不同于CD40 的非持續(xù)表達(dá)，需在CD40 誘導(dǎo)作用后表達(dá)。CD40/CD40L 交聯(lián)所介導(dǎo)的免疫炎癥細(xì)胞之間和組織間質(zhì)細(xì)胞之間的相互激活、相互作用構(gòu)成了組織炎癥和纖維化的基礎(chǔ)［23］。MCP-1 是趨化因子CC 亞家族的成員，近年來(lái)研究顯示，趨化因子在保護(hù)宿主、炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。MCP-1 主要趨化血液中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進(jìn)入感染發(fā)生的部位。該信號(hào)通路可以激活淋巴細(xì)胞和促炎因子及趨化因子的產(chǎn)生，上述炎癥因子及趨化因子產(chǎn)生后又可進(jìn)一步激活CD40/CD40L系統(tǒng)而導(dǎo)致惡性循環(huán)，在細(xì)胞粘附、血栓形成、組織纖維化多種病理過(guò)程中，是觸動(dòng)“炎癥式級(jí)聯(lián)反應(yīng)”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［24］。為此，調(diào)控啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)的共刺激，可能是防止術(shù)后粘連的一個(gè)重要途徑。

腹腔粘連難以避免的一個(gè)原因就是創(chuàng)傷導(dǎo)致腹部損傷后，可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)感染的易感性增加，而易感性增加的機(jī)制之一就是傷后出現(xiàn)的免疫功能紊亂。腹腔粘連一旦發(fā)生很難控制，難以控制的機(jī)制之一同樣是由于傷后出現(xiàn)的免疫功能紊亂。免疫功能紊亂之所以會(huì)發(fā)生，是源于機(jī)體防御機(jī)制對(duì)創(chuàng)傷刺激所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)的原始目的是為了抵御或者清除刺激，保護(hù)機(jī)體和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而當(dāng)創(chuàng)傷刺激過(guò)于強(qiáng)烈時(shí)，超越正常防御機(jī)制的自控能力，會(huì)出現(xiàn)異常應(yīng)激反應(yīng)。

免疫跟炎癥反應(yīng)通常是同時(shí)發(fā)生的，二者可以相互促進(jìn)。免疫細(xì)胞可以分泌炎癥介質(zhì)加劇炎癥，炎癥過(guò)程中可以使更多免疫細(xì)胞進(jìn)入組織中，免疫細(xì)胞可以分泌更多的細(xì)胞因子進(jìn)一步放大免疫，本實(shí)驗(yàn)中HE 病理切片和大鼠外周血證實(shí)此點(diǎn)。模型組中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，纖維蛋白的滲出明顯多于假手術(shù)組，過(guò)度的炎性水腫又使得組織功能受損。而活血通腑方各組能不同程度稀釋毒素，清除致病因素，減少免疫細(xì)胞活化后釋放細(xì)胞趨化因子，從而減輕炎癥反應(yīng)。不同炎癥反應(yīng)引發(fā)不同的生理學(xué)變化及不同的病理學(xué)后果［25］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)銼刀法建立大鼠腹腔粘連模型，與假手術(shù)組大鼠相比，術(shù)后第1、3、5、7、14 天模型組大鼠一般狀態(tài)差，手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致CD40 和CD40L 升高，尤其是引起模型組大鼠外周血中單核細(xì)胞CD40 和CD40L 升高。通過(guò)評(píng)估鏡下病理積分發(fā)現(xiàn)，PPA大鼠模型炎性細(xì)胞隨時(shí)間變化分布不同，推測(cè)與MCP-1 蛋白有關(guān)。免疫組化結(jié)果表明各組CD40、CD40L 和MCP-1 蛋白水平隨時(shí)間推移亦呈下降趨勢(shì)，模型組在術(shù)后第1、3、14 天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與術(shù)后腹腔粘連大鼠術(shù)后第3、5、14 天肉眼粘連評(píng)分結(jié)果趨勢(shì)吻合，上述結(jié)果表明術(shù)后第1 ～3 天為重要的窗口期，此時(shí)給予活血通腑方干預(yù)可一定程度避免腹腔粘連的形成。可能的機(jī)制如下:手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激升高CD40、CD40L 等免疫細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫功能紊亂，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子失衡，最終導(dǎo)致大鼠腹腔粘連發(fā)生?；谝陨嫌^點(diǎn)，我們可以得出CD40 與CD40L 結(jié)合后啟動(dòng)炎性反應(yīng)，包括誘導(dǎo)一系列與術(shù)后腹腔粘連發(fā)生有關(guān)的趨化因子等表達(dá)。

綜上，活血通腑方可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同細(xì)胞因子作用途徑來(lái)影響免疫的強(qiáng)度，從而減少炎癥對(duì)組織的不利影響。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步佐證，阻斷CD40/CD40L 信號(hào)通路可顯著減輕術(shù)后腹腔粘連大鼠外周血單核細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，且腹腔粘連的評(píng)分顯著降低，對(duì)腹腔粘連的防治具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］ ten Broek R P，Wilbers J，van Goor H. Electrocautery causes more ischemic peritoneal tissue damage than ultrasonic dissection［J］. Surg Endosc，2011，25(6):1827-1834.

［2］ Trochsler M，Maddern G J. Adhesion barriers for abdominal surgery:a sticky problem［J］. Lancet，2014，383(9911):8-10.

［3］ Kimura F，Shimizu H，Yoshidome H，et al. Immunosuppression following surgical and traumatic injury［J］. Surg Today，2010，40(9):793-808.

［4］ Guo H，Leung J C，Cheung J S，et al. Non-viral Smad7 gene delivery and attenuation of postoperative peritoneal adhesion in an experimental model［J］. Br J Surg，2009，96 (11):1323-1335.

［5］ Sammour T，Kahokehr A，Soop M，et al. Peritoneal damage:the inflammatory response and clinical implications of the neuroimmuno-humoral axis［J］. World J Surg，2010，34 (4):704-720.

［6］ Hamming J F，Bonsing B A. Adhesiolysis during abdominal surgery:substantial risks［J］. Ned Tijdschr Geneeskd，2013，157(7):A5928.

［7］ Jiang C G，Lv L，Liu F R，et al. Connective tissue growth factor is a positive regulator of epithelial-mesenchymal transition and promotes the adhesion with gastric cancer cells in human peritoneal mesothelial cells［J］. Cytokine，2013，61(1):173-180.

［8］ Corona R，Verguts J，Schonman R，et al. Postoperative inflammation in the abdominal cavity increases adhesion formation in a laparoscopic mouse model［J］. Fertil Steril，2011，95(4):1224-1228.

［9］ Binneb?sel M，Klink C D，Serno J，et al. Chronological evaluation of inflammatory mediators during peritoneal adhesion formation using a rat model［J］. Langenbecks Arch Surg，2011，396(3):371-378.

［10］ Chatzigeorgiou A，Lyberi M，Chatzilymperis G，et al. CD40/CD40L signaling and its implication in health and disease［J］.Biofactors，2009，35(6):474-483.

［11］ 曾 莉，俞晶華，翟亞春，等. 活血通腑方對(duì)大鼠術(shù)后血FIB、FDP 水平的影響［J］. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2004，7(22):1655-1656.

［12］ 曾 莉，陳衛(wèi)平，凌立君，等. 活血通腑方抗實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連機(jī)理研究［J］. 中國(guó)中醫(yī)急癥，2006，15 (6):634-636.

［13］ 曾 莉，陳衛(wèi)平，趙鳳鳴，等. 活血通腑方對(duì)實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連TGF-β mRNA 表達(dá)的影響［J］. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(12):2236-2238.

［14］ 顏 帥，楊 斕，曾 莉，等. 活血通腑方優(yōu)化方防治大鼠術(shù)后腹腔粘連的最佳有效劑量［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(9):166-170.

［15］ 中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部. 關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)［S］. 2006.

［16］ Phillips R K，Dudley H A. The effect of tetracycline lavage and trauma on visceral and parietal peritoneal ultrastructure and adhesion formation［J］. Br J Surg，1984，71(7):537-539.

［17］ Bhatia D S，Allen J E. The prevention of experimentally induced postoperative adhesions［J］. Am Surg，1997，63(9):775-777.

［18］ Mahdy T，Mohamed G，Elhawary A. Effect of methylene blue on intraabdominal adhesion formation in rats［J］. Int J Surg，2008，6(6):452-455.

［19］ Chatzigeorgiou A，Lyberi M，Chatzilymperis G，et al. CD40/CD40L signaling and its implication in health and disease［J］.Biofactors，2009，35(6):474-483.

［20］ O'Sullivan B，Thomas R. CD40 and dendritic cell function［J］. Crit Rev Immunol，2003，23(1-2):83-107.

［21］ Basok A，Shnaider A，Man L，et al. CD40 is expressed on human peritoneal mesothelial cells and upregulates the production of interleukin-15 and RANTES［J］. J Am Soc Nephrol，2001，12(4):695-702.

［22］ Santilli F，Basili S，F(xiàn)erroni P，et al. CD40/CD40L system and vascular disease［J］. Intern Emerg Med，2007，2 (4):256-268.

［23］ Kawai M，Masuda A，Kuwana M. A CD40-CD154 interaction in tissue fibrosis［J］. Arthritis Rheum，2008，58 (11):3562-3573.

［24］ Elzey B D，Ratliff T L，Sowa J M，et al. Platelet CD40L at the interface of adaptive immunity［J］. Thromb Res，2011，127(3):180-183.

［25］ Medzhitov R. Origin and physiological roles of inflammation［J］. Nature，2008，454(7203):428-435.