海水常見革蘭氏陰性病原菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展

丁曉燕，朱鵬飛，王敏強(qiáng)，曲凌云*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061)

海水常見革蘭氏陰性病原菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展

丁曉燕1，2，朱鵬飛2，王敏強(qiáng)1，曲凌云2*

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061)

許多革蘭氏陰性病原細(xì)菌借助細(xì)菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS)傳遞與致病有關(guān)的毒性因子和效應(yīng)子來(lái)發(fā)揮病原細(xì)菌的毒性。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是海水中3種常見革蘭氏陰性病原細(xì)菌。這3種細(xì)菌不僅廣泛引起海水養(yǎng)殖生物的病害，還經(jīng)常導(dǎo)致人類腸胃炎等其他危害，而Ⅲ型分泌系統(tǒng)也與它們的致病性密切相關(guān)。對(duì)海水中這3種常見革蘭氏陰性病原菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成、功能及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了綜述。

革蘭氏陰性病原菌；Ⅲ型分泌系統(tǒng)；毒力因子

海水養(yǎng)殖環(huán)境中存在多種具有條件致病性的革蘭氏陰性菌，比如副溶血弧菌。副溶血弧菌是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，不僅能引起人類食物中毒性腸胃炎，還可引起水生動(dòng)物(如海鯛、對(duì)蝦、九孔鮑、文蛤等[1])疾病。嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，在自然界廣泛分布，可以感染多種水生及陸生動(dòng)物，是一種重要的人、獸、魚共患病病原菌[2]。遲緩愛(ài)德華氏菌是一種革蘭氏陰性腸道病原菌，感染宿主范圍廣，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生物中該菌是魚類鰻、鲇和鲆等的重要致病菌[3]。目前，對(duì)病原菌的致病機(jī)理研究較多，溶血素、粘附因子和胞外蛋白等多種胞外物質(zhì)被認(rèn)為與病原菌的毒力有關(guān)，然而這些毒力因子不足以引起嚴(yán)重的致病癥狀，可能存在其他毒力較強(qiáng)的致病因子[4-6]。關(guān)于細(xì)菌毒力因子的鑒定和特征分析已取得許多進(jìn)展，盡管如此不同毒力因子之間的聯(lián)系以及進(jìn)入宿主細(xì)胞的順序仍然未確定[7]。

細(xì)菌分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)是近年來(lái)細(xì)菌致病機(jī)制研究的重要進(jìn)展。系統(tǒng)發(fā)育和遺傳進(jìn)化分析表明，細(xì)菌是通過(guò)幾種分泌機(jī)制將蛋白性質(zhì)的毒力因子分泌出去的。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)7種類型的分泌系統(tǒng)，它們以各自特有的方式參與細(xì)菌的致病過(guò)程[8]。其中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS)與動(dòng)植物革蘭陰性病原菌的毒力因子分泌有關(guān)，因此備受關(guān)注。Ⅲ型分泌系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中，由George P.C.Salmond和Philip J.Reeves[9]于1993年首次命名，該系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性菌(如志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、弧菌、假單胞菌和植物病原菌歐文氏菌屬、黃單胞菌屬等)中。海水環(huán)境中的某些革蘭陰性病原菌中也發(fā)現(xiàn)具有T3SS系統(tǒng)，Kwon-Sam Park等[10]證實(shí)副溶血弧菌T3SS具有對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞毒性和腸毒性；Tan等[11]發(fā)現(xiàn)將遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS相關(guān)基因突變后，突變株在魚類巨噬細(xì)胞中的存活、復(fù)制和殺死魚類細(xì)胞的能力都減弱；G.A.Carvalho-Castro等[12]利用PCR 技術(shù)檢測(cè)從病魚中分離的嗜水氣單胞菌的T3SS，結(jié)果表明完整T3SS的存在增加了嗜水氣單胞菌的毒性。多位生物學(xué)家通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)副溶血弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)對(duì)真核細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[13-16]，Ⅲ型分泌系統(tǒng)的存在與否直接影響病原菌的毒性強(qiáng)弱[15，17-18]。 筆者以副溶血弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌3種水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見的革蘭陰性病原菌為研究對(duì)象，對(duì)其Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成、相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白、效應(yīng)蛋白的功能以及相關(guān)表達(dá)調(diào)控過(guò)程的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

Ⅲ型分泌系統(tǒng)存在于革蘭氏陰性菌中，廣泛參與革蘭氏陰性菌毒力因子的分泌，編碼T3SS的基因通常成簇地以毒力島(Pathogenicity island，PI)的形式存在于細(xì)菌的染色體或質(zhì)粒上。與基因組其他部分相比，該分泌系統(tǒng)基因的GC含量較低或較高，目前認(rèn)為是可轉(zhuǎn)移的外源基因插入成分，通過(guò)水平傳遞而獲得[19]。

所有已知?jiǎng)又参镏虏【蘑笮头置谙到y(tǒng)都有許多高度保守的主要結(jié)構(gòu)成分。Ⅲ型分泌系統(tǒng)由20種以上的蛋白質(zhì)組成，是所有已知的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)中最復(fù)雜的[20]，其組分包括分泌蛋白、伴侶蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。調(diào)節(jié)蛋白對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。分泌蛋白需要小的、通常是酸性、位于細(xì)胞質(zhì)膜的附屬蛋白，特異性地與之結(jié)合，這種附屬蛋白質(zhì)被稱為伴侶蛋白[21]。分子伴侶能夠穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)內(nèi)相應(yīng)的底物，阻止相應(yīng)底物自身及其他效應(yīng)蛋白或轉(zhuǎn)位子蛋白未成熟前的同種或異種蛋白的結(jié)合，這種結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合蛋白的失活[22]。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)的外排裝置由幾種完整的膜蛋白組成，橫跨細(xì)胞內(nèi)、外膜，并延伸形成一個(gè)針狀結(jié)構(gòu)通向胞外。各菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)在分泌功能上具有相似性，組織結(jié)構(gòu)上卻各有不同。雖然Ⅲ型分泌系統(tǒng)附屬組件的結(jié)構(gòu)和對(duì)稱性是多元化的，但研究表明這些系統(tǒng)是由同源蛋白分子組裝而成[23]。從圖1可以看出，通用結(jié)構(gòu)為多環(huán)基底結(jié)構(gòu)嵌入內(nèi)、外膜和細(xì)胞周質(zhì)間隙中，基底端與胞內(nèi)的外排裝置和復(fù)雜ATP酶系統(tǒng)接觸，末端針狀的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)毒力蛋白，通過(guò)周質(zhì)和胞外環(huán)境直接進(jìn)入宿主細(xì)胞。Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌裝置與鞭毛結(jié)構(gòu)上有相似之處，可能由細(xì)菌鞭毛進(jìn)化而來(lái)[24]。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)受到接觸誘導(dǎo)后分泌與毒力有關(guān)的多種蛋白質(zhì)注入宿主細(xì)胞內(nèi)，這些蛋白稱為效應(yīng)蛋白。Ⅲ型分泌系統(tǒng)可釋放幾種效應(yīng)蛋白，刺激宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致一系列的細(xì)胞效應(yīng)[9]，如肌動(dòng)蛋白的變構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排、轉(zhuǎn)錄因子的激活、離子通道的刺激、在某些細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡等。這個(gè)分泌和轉(zhuǎn)移過(guò)程是由非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的機(jī)制調(diào)控的。

2 副溶血弧菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)

2.1 副溶血弧菌T3SS的組成2002年Tagomori[25]完成第1株副溶血弧菌全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌含有2套Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)，分別為T3SS1和T3SS2，后者是關(guān)鍵的毒力系統(tǒng)，可以細(xì)分為T3SS2ɑ和T3SS2β。T3SS1位于染色體1上，有30個(gè)開放閱讀框，序列與其他革蘭氏陰性菌的T3SS相關(guān)基因有一定同源性。T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分離株中，其GC含量與基因組其他區(qū)域有差別，被認(rèn)為是該菌的遺傳標(biāo)記之一[26]。T3SS1的分泌裝置由一系列結(jié)構(gòu)蛋白組成，包括內(nèi)膜蛋白VcrD1、外膜蛋白VscC1以及細(xì)胞周質(zhì)蛋白VscN1[10]。 Ono T[13]等利用二維凝膠電泳對(duì)副溶血弧菌T3SS1突變株及其親本株的分泌蛋白進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了T3SS1的4個(gè)分泌蛋白，分別為VP1656(VopD)、VP1680、VP1686和VPA450。Waddell B等[27]鑒定出VPA0451是VPA0450的特異性分子伴侶。VPA0451與已知的T3SS1分子伴侶結(jié)構(gòu)相似，VPA0450轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞需要VPA0451的協(xié)助。VPA0451直接結(jié)合于VPA0450，25～100位氨基酸是VPA0451的活性部位。因此，確定VPA0451是迄今為止發(fā)現(xiàn)的T3SS1的第2個(gè)分子伴侶。

T3SS2位于染色體2的毒力島上[28]。副溶血弧菌KP+株擁有2種tdh基因，分別是tdhA和tdhS，不能同時(shí)擁有trh基因[29-31]；KP-株則擁有trh基因或者trh和tdh基因[10，32]。Okada N 等[33]對(duì)trh+副溶血弧菌TH3996株測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在trh基因附近100 kb左右的DNA區(qū)域存在1種新的T3SS基因，經(jīng)過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)及PCR分析發(fā)現(xiàn)這種T3SS基因存在于所有的被檢測(cè)的trh+菌株中，并且對(duì)于細(xì)菌的胞外毒性必不可少，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明這種T3SS與KP+的T3SS2雖然有很近的關(guān)系，但卻屬于不同的系，這種新的T3SS2即T3SS2β。擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌也存在T3SS2ɑ和T3SS2β基因，并且擬態(tài)弧菌與霍亂弧菌的關(guān)系更近。擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌的T3SS2基因可能是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移得到的[34]。與T3SS1相似，副溶血弧菌vcrD2、vscC2和vscN2分別編碼了T3SS2的內(nèi)膜蛋白，外膜蛋白和細(xì)胞周質(zhì)蛋白[10]。ZHOU等[28]用二維凝膠電泳方法對(duì)親本株(敲除T3SS1結(jié)構(gòu)基因vscN1的菌株)和突變株(敲除掉T3SS1和T3SS2的結(jié)構(gòu)基因vscN1、vscN2的菌株)所分泌的蛋白進(jìn)行對(duì)比分析，其中VopL、 VopT、VopA、VopV 和 VopC是已知的效應(yīng)蛋白，VopB2、 VopD2 和VopW是T3SS2易位子的組成部分，是分泌裝置的一部分，VopcC 是VopC的分子伴侶，另外還有VPA1336(VopZ)、 VPA1350、VPA1343；VPA1343 是T3SS2的分泌裝置，VPA1350在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)作用。Akeda Y等[35]研究發(fā)現(xiàn)VocC是T3SS2效應(yīng)蛋白VopC和VopL的分子伴侶。

2.2 副溶血弧菌T3SS的作用副溶血弧菌T3SS1主要貢獻(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性，介導(dǎo)宿主細(xì)胞的自體吞噬作用，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。T3SS1的分泌蛋白中VopQ/A(VP1680)是T3SS1介導(dǎo)真核細(xì)胞毒性的最主要蛋白，具有對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性。Sreelatha A等[36]研究表明即使環(huán)境中存在自噬的化學(xué)抑制劑，VopQ也足以引發(fā)宿主細(xì)胞的快速自噬，VopQ在溶酶體膜表面形成小孔，使溶酶體釋放小于350 D的分子，從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬。VopD也具有對(duì)Hela細(xì)胞的毒性，此外還具有溶血活性。VP1686不僅能通過(guò)抑制NF-JB的活性來(lái)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡[37]，還能通過(guò)抑制RhoB的鳥苷三磷酸酶及下游的信號(hào)傳導(dǎo)，阻止被感染細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的聚集和巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的快速重排，有助于抵抗巨噬細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬作用[38-40]。

副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，具有腸毒性。目前共鑒定出6種副溶血弧菌T3SS2的效應(yīng)蛋白，VopA能活化激酶催化環(huán)結(jié)構(gòu)中保守的賴氨酸乙?；柚笰TP的結(jié)合，最終阻止激酶的磷酸化[41]。VopT(VPA1327)具有核糖轉(zhuǎn)移酶活性，部分貢獻(xiàn)T3SS2對(duì)Caco-2的細(xì)胞毒性[14]。VopL(VPA1370)能誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白抗壓纖維的形成，并加速肌動(dòng)蛋白纖維絲的聚集[42]。VopC(VPA1321)與大腸桿菌細(xì)胞毒性壞死因子的同源性達(dá)38%[43]。Zhou等[28]首次闡明了VopZ在誘導(dǎo)腹瀉中發(fā)揮獨(dú)特作用，VopZ抑制絲裂原活化蛋白激酶MAP3K7(TAK1)的啟動(dòng)，控制MAPK和 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞分裂。此外，N-末端玻尿酸標(biāo)記的VopZ能夠在Hela細(xì)胞表面形成小孔。因此，VopZ對(duì)副溶血弧菌在腸道內(nèi)的增殖作用不大，而有助于該菌在腸道內(nèi)引起腹瀉和組織破壞等疾病。

副溶血弧菌T3SS2效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞中需要通過(guò)3種蛋白質(zhì)形成的膜通道，分別為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 VopB2、VopD2和VopW。Zhou X等[18]研究表明VopW幫助另外2種蛋白質(zhì)插入宿主細(xì)胞膜形成膜通道，對(duì)效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞必不可少。利用vopW基因的缺失菌株感染動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)菌株無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)已知的T3SS2分泌蛋白到宿主細(xì)胞中，也無(wú)法檢測(cè)到其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白插入到宿主細(xì)胞膜中，而且在感染動(dòng)物模型試驗(yàn)中缺失株是無(wú)毒的，這些結(jié)果結(jié)合VopW的大小和預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，揭示VopW是副溶血弧菌的親水性轉(zhuǎn)運(yùn)成分，引導(dǎo)VopD2 和VopB2 組裝并插入到宿主細(xì)胞膜孔。另外，VopW自身可以轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，可能既是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又是效應(yīng)蛋白。

2.3 副溶血弧菌T3SS的主要調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)制副溶血弧菌ExsA與ExsD能夠調(diào)控T3SS1基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，ExsA為正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控，ExsD為負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)控[44]。Zhou X等[45]通過(guò)不同抗原標(biāo)記的重組蛋白共表達(dá)試驗(yàn)表明ExsC結(jié)合ExsD，并且ExsC的N-末端對(duì)結(jié)合十分必要?？乖瓨?biāo)記的ExsA和ExsD的共表達(dá)和純化試驗(yàn)表明ExsD直接結(jié)合ExsA，猜測(cè)這種結(jié)合阻止了ExsA與T3SS1基因啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合?？傮w而言，這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明ExsD 結(jié)合ExsA阻止T3SS1的表達(dá)，ExsC結(jié)合ExsD 釋放ExsA，從而允許T3SS1的表達(dá)，副溶血弧菌ExsA、ExsC和ExsD與銅綠假單胞菌調(diào)節(jié)因子在功能上有直系同源性。

3 嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)

3.1 嗜水氣單胞菌T3SS的組成Yu等[46]首次報(bào)道了嗜水氣單胞菌AH-1株中存在T3SS，利用基因步移法克隆了全長(zhǎng)的T3SS序列，其中包括5個(gè)啟動(dòng)子和25個(gè)開放閱讀框表達(dá)25種T3SS組分蛋白。AexT和AexU是嗜水氣單胞菌的效應(yīng)蛋白。AopN 蛋白是T3SS的重要組成部分，它是外在膜蛋白，ascV和aopB基因的編碼產(chǎn)物是嗜水氣單胞菌T3SS的必要構(gòu)成成分，前者編碼與T3SS固定在細(xì)菌內(nèi)膜有關(guān)的蛋白，后者編碼的蛋白是易位子的組裝成分。Sha等[47]根據(jù)耶爾森菌T3SS基因yscV設(shè)計(jì)探針，在嗜水氣單胞菌人源腹瀉分離株SSU基因組文庫(kù)中檢測(cè)到全長(zhǎng)26 855 bp的T3SS，共35個(gè)開放閱讀框。通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌AH-1株和SSU株的T3SS序列的比較發(fā)現(xiàn)，二者的同源性不高?；蛐蛄械淖兓赡軙?huì)改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而產(chǎn)生不同的效應(yīng)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，這也解釋了雖然包括無(wú)毒株在內(nèi)的許多嗜水氣單胞菌都含有T3SS，但其結(jié)構(gòu)不完全相同，也許決定了它們毒力方面的差異。

3.2 嗜水氣單胞菌T3SS的作用現(xiàn)已證實(shí)，嗜水氣單胞菌存在2個(gè)效應(yīng)蛋白(AexT[43，48]和AexU)，殺鮭氣單胞菌存在4個(gè)效應(yīng)蛋白(AexT[49]、AopP[50]、AopH和AopO)。AexT是嗜水氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)效應(yīng)蛋白，也是最小的效應(yīng)蛋白。Vilches S等[45]對(duì)嗜溫的嗜水氣單胞菌AH-3 株T3SS分泌的ADP-核糖基化毒素(AexT)進(jìn)行克隆和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)AexT與殺鮭氣單胞菌AexT的前半部分具有同源性。AexT具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，aexT基因缺失株的毒性與野生株相比輕微減小，而T3SS基因缺失株的毒性則大大降低。

Sierral等[15]證實(shí)嗜水氣單胞菌SSU株AexU作為ADP-核糖化轉(zhuǎn)移酶和GTP酶活化蛋白，參與宿主細(xì)胞的凋亡和肌動(dòng)蛋白的分解，AexU可以阻止c-Jun、JNK和JκB的磷酸化并抑制Hela細(xì)胞1L-6和1L-8的分泌，從而抑制NF-κB和Rho GTP酶的活性。AexU與銅綠假單胞菌ExoT/S同源，氨基末端與耶爾森氏菌YopE活性相似，AexU 約有67%的序列與 AexT相似，然而其羧基端序列不與任何已知的蛋白質(zhì)序列同源[44]。AexU羧基端的單核苷酸替換率約為17%，而AexT則要保守得多，其單核苷酸替換率在4%左右，或許AexU羧基端是獨(dú)立于氨基端進(jìn)化的，這不僅能產(chǎn)生不同的等位基因，而且產(chǎn)生多種 AexU效應(yīng)蛋白以適應(yīng)宿主體內(nèi)不斷變化的環(huán)境。此外，溫和氣單胞菌AexU共定位β4-整合蛋白，產(chǎn)生應(yīng)對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒素[51]。

ascV和aopB基因是嗜水氣單胞菌T3SS的必要構(gòu)成成分，前者編碼與T3SS固定在細(xì)菌內(nèi)膜有關(guān)的蛋白，后者編碼的蛋白是易位子的組裝成分。G.A.Carvalho Castro等[12]利用PCR技術(shù)從T3SS中檢測(cè)ascV和aopB基因，估測(cè)2種基因在嗜水氣單胞菌病原菌和環(huán)境分離株中的頻率，2種基因有3種存在方式：ascV+/aopB+、ascV+/aopB-和ascV-/aopB-。檢測(cè)到的64株病魚分離菌ascV+/aopB+頻率最高(62.5%)，說(shuō)明ascV+/aopB+病原菌能夠引起魚類極高的死亡率。環(huán)境分離株雖然有T3SS結(jié)構(gòu)，但是毒力很低。PCR技術(shù)可以有效鑒定T3SS，并且可以將嗜水氣單胞菌的毒力因子進(jìn)行分類。謝振宣等[52]利用自殺性質(zhì)粒成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌J-1株ascV基因的缺失突變株，該突變株許多胞外產(chǎn)物缺失，毒力消失，說(shuō)明AscV在嗜水氣單胞菌J-1株的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.3 嗜水氣單胞菌T3SS的主要調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)制從圖2可以看出，嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達(dá)與其他毒力因子之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，如脂多糖、ahyIR群體感應(yīng)系統(tǒng)、PhoPQ雙組份系統(tǒng)和復(fù)雜的丙酮酸脫氫酶等。PhoPQ系統(tǒng)對(duì)胞外鎂離子濃度敏感，低濃度鎂離子激活PhoPQ的轉(zhuǎn)錄，高濃度則抑制其轉(zhuǎn)錄，PhoPQ抑制T3SS的表達(dá)。為了研究嗜水氣單胞菌T3SS在體內(nèi)的表達(dá)，Vilches S等[53]用綠色熒光蛋白標(biāo)記和實(shí)時(shí)定量PCR方法分析aopN-aopD和aexT基因啟動(dòng)區(qū)的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌AH-3菌株T3SS的表達(dá)，其中鈣的消耗和高濃度鎂離子是誘導(dǎo)T3SS表達(dá)最主要的因素，溫度升高也能促進(jìn)其表達(dá)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌脂多糖結(jié)構(gòu)與T3SS效應(yīng)蛋白的產(chǎn)生有關(guān)，O-抗原結(jié)構(gòu)的改變影響細(xì)菌表面的親水特性，從而影響T3SS機(jī)制活化的信號(hào)感知。鞭毛基因的突變也降低了aopN-aopD和aexT啟動(dòng)子的活性，說(shuō)明鞭毛和T3SS之間存在交叉調(diào)控[54]。RpoN基因?qū)τ谑人畾鈫伟鶤H-3 的極性和橫向鞭毛的產(chǎn)生是必不可少的。PDHc基因的突變降低了T3SS的表達(dá)，說(shuō)明PDHc對(duì)于T3SS的表達(dá)是必不可少的。嗜水氣單胞菌AH-3株T3SS調(diào)節(jié)子群體感應(yīng)系統(tǒng)正向調(diào)節(jié)T3SS結(jié)構(gòu)蛋白的生成[50]。在誘導(dǎo)T3SS表達(dá)的情況下，嗜水氣單胞菌AH-3axsA基因突變株的T3SS活性與野生株相比大幅下降，而AxsA與銅綠芽胞桿菌ExsA區(qū)域相似[55]，存在類似的結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明AxsA 是嗜水氣單胞菌AH-3 株T3SS的主要調(diào)節(jié)因子。由于T3SS結(jié)構(gòu)基因和aexT基因不在同一基因組區(qū)域，所以AxsA的調(diào)控是一個(gè)通用調(diào)控途徑，而AopN的缺失打開T3SS通道，激活正向反饋機(jī)制，從而激活A(yù)xsA，而AxsA促進(jìn)T3SS的表達(dá)[50]。細(xì)菌存在一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，能將T3SS的生成和細(xì)菌功能聯(lián)系起來(lái)，說(shuō)明毒力因子表達(dá)的精確時(shí)間與協(xié)調(diào)性對(duì)于感染過(guò)程十分必要。

4 遲緩愛(ài)德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)

4.1 遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS的組成Tan等[11]利用染色體步移技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS基因，鑒定出35個(gè)開放閱讀框，編碼T3SS結(jié)構(gòu)蛋白、分子伴侶、效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS基因與沙門氏菌毒力島2(SPI2)編碼的T3SS基因同源，遲緩愛(ài)德華氏菌3種效應(yīng)蛋白分別與沙門氏菌效應(yīng)蛋白SseB、C、D同源，于是分別命名為EseB、C、D。T3SS編碼區(qū)域有30 756 bp，GC含量高于Ed.tarda染色體組，而SPI2的GC含量則低于染色體組。遲緩愛(ài)德華氏菌的效應(yīng)蛋白基因?yàn)閑seB、eseC、eseD和eseE，伴侶蛋白基因?yàn)閑scA、escB和escC，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因?yàn)閑srA-esrB，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因?yàn)閑srC。

4.2 遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS的作用插入失活調(diào)節(jié)蛋白基因esrA和esrB，裝置蛋白基因esaC，分子伴侶基因escA，分別觀察細(xì)菌在魚類巨噬細(xì)胞的存活和復(fù)制能力、對(duì)無(wú)吞噬能力的EPC細(xì)胞的粘附和內(nèi)化能力以及魚類的半數(shù)致死量。研究發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，突變株的存活、復(fù)制和殺死魚類細(xì)胞的能力都減弱；esrA和esrB突變株降低遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)細(xì)胞的粘附和內(nèi)化能力[17]。李杰等[56]利用框內(nèi)缺失突變技術(shù)進(jìn)行esaC定點(diǎn)突變，研究發(fā)現(xiàn)esaC基因的缺失影響效應(yīng)蛋白EseB、EseC和EseD的分泌，但不影響在胞內(nèi)的表達(dá)。這可能是因?yàn)閑saC的缺失影響遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS孔道結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響蛋白的正常分泌。

Wang Bo[57]等利用框內(nèi)缺失突變法構(gòu)建eseD基因突變株，與野生株相比eseD缺失突變株的效應(yīng)蛋白EseC和EseB分泌水平降低，菌株的群集運(yùn)動(dòng)能力和接觸溶血能力衰減，但生物膜合成能力增加。互補(bǔ)表達(dá)后表型恢復(fù)到與野生株類似。侵染試驗(yàn)表明eseD缺失突變株復(fù)制能力降低，對(duì)魚類的毒力降低10倍。這些結(jié)果表明EseD在E.tarda致病性中有特定作用。插入失活效應(yīng)蛋白基因eseB，突變株在培養(yǎng)基中的自凝聚能力下降，說(shuō)明EseB可能是胞外纖毛或者附屬物的組成成分。當(dāng)細(xì)菌在中性或堿性環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，EseB、C、D的分泌量達(dá)到最大值。研究發(fā)現(xiàn)，包含野生菌的吞噬體呈酸性，而包含T3SS突變體的吞噬體呈堿性，說(shuō)明T3SS干擾巨噬細(xì)胞形成酸性環(huán)境對(duì)于遲緩愛(ài)德華氏菌胞內(nèi)復(fù)制是十分必要的[17]。EseB、EseC和EseD蛋白是E.tardaT3SS輸送器的組成成分，在分泌到細(xì)菌細(xì)胞外后可以組成輸送器裝置。

分子伴侶對(duì)于輸送器蛋白的穩(wěn)定和分泌具有重要的作用。EscC被鑒定為EseB和EseD的伴侶蛋白，并影響EseB和EseD的分泌和穩(wěn)定性[58]。Okuda J等[59]研究發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白基因escC和位于T3SS基因簇上的orf13、orf19、orf29和orf30基因?qū)τ谶t緩愛(ài)德華氏菌侵染斑馬魚是必不可少的。

EscA是EseC的分子伴侶并貢獻(xiàn)遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)宿主細(xì)胞的毒力。escA基因位于eseC基因上游，框內(nèi)缺失escA基因的突變株不影響eseC基因的轉(zhuǎn)錄，但是通過(guò)EseC-LacZ融合蛋白檢測(cè)到eseC在細(xì)胞內(nèi)的積累水平減少。進(jìn)一步研究表明，EseC蛋白31～137氨基酸殘基對(duì)于EseC-EscA的反應(yīng)不可缺少[60]。

4.3 遲緩愛(ài)德華氏菌T3SS的主要調(diào)控因子和調(diào)控機(jī)制為了生存和適應(yīng)外界環(huán)境的變化，細(xì)菌通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)響應(yīng)環(huán)境信號(hào)并對(duì)刺激作出應(yīng)答(圖3)。雙組分系統(tǒng)(Two-component system，TCS)是細(xì)菌最關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，與病原菌在宿主體內(nèi)外不同環(huán)境條件下的適應(yīng)能力密切相關(guān)。遲緩愛(ài)德華氏菌TCS協(xié)同全局調(diào)控蛋白和σ因子等調(diào)控元件共同作用。EsrA/EsrB系統(tǒng)調(diào)控T3SS蛋白的表達(dá)和分泌，值得注意的是EsrB還通過(guò)T3SS基因簇編碼的AraC家族的調(diào)控蛋白EsrC來(lái)調(diào)控T6SS和部分T3SS基因的表達(dá)[61]。此外，發(fā)現(xiàn)EsrB協(xié)同核酸結(jié)合蛋白Hha共同抑制溶血素基因tdhA的表達(dá)。遲緩愛(ài)德華氏菌EsrB和PhoP為主要的毒力調(diào)控因子，PhoP通過(guò)2條途徑作用毒力：①對(duì)T3SS和T6SS的調(diào)控；②對(duì)CAMP的抵抗。通過(guò)對(duì)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(Ugd)的功能鑒定和表達(dá)分析，揭示了PhoP通過(guò)調(diào)控Ugd介導(dǎo)抵抗宿主陽(yáng)離子抗菌肽(CAMP)的殺傷作用[62]。 外界環(huán)境的變化也影響細(xì)菌分泌系統(tǒng)的表達(dá)，遲緩愛(ài)德華氏菌在感染過(guò)程中經(jīng)歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS受到溫度的調(diào)控，研究表明在37 ℃條件下細(xì)菌生長(zhǎng)快，T3SS結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量較低[63]；在28 ℃條件下，T3SS的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)最高。在28和37 ℃的培養(yǎng)條件下，中性和堿性分別適合細(xì)菌的生長(zhǎng)和T3SS結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。遲緩愛(ài)德華氏菌群體感應(yīng)系統(tǒng) QesB-QseC影響由鞭毛和纖毛形成的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，并通過(guò)介導(dǎo)腎上腺素信號(hào)調(diào)控鞭毛合成元件及分泌系統(tǒng)元件的表達(dá)，影響菌株的運(yùn)動(dòng)能力和對(duì)宿主細(xì)胞的粘附能力[58]。

5 小結(jié)

近年來(lái)，海水養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，為人們創(chuàng)造巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也帶來(lái)了負(fù)面影響，比如細(xì)菌病害的泛濫。這是由于目前國(guó)內(nèi)對(duì)水產(chǎn)病原菌的治療主要依靠抗生素，隨著抗生素的大量使用，細(xì)菌的耐藥廣譜越來(lái)越大，并且引起了環(huán)境污染的問(wèn)題，因此抗生素的作用也受到限制。因此，亟待解決的問(wèn)題是找到一種環(huán)境危害小、方便又高效的方法來(lái)防治水產(chǎn)疾病。

副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和遲緩愛(ài)德華氏菌都是嚴(yán)重的魚類致病菌，其中T3SS是重要的毒力因子。自發(fā)現(xiàn)T3SS以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白和調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行了深入研究，認(rèn)識(shí)水平有了很大提高。作為一種病原菌向宿主細(xì)胞內(nèi)靶向轉(zhuǎn)運(yùn)毒力蛋白的系統(tǒng)，T3SS是病原菌與宿主相互作用的重要界面，當(dāng)受到接觸誘導(dǎo)后分泌多種效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞，導(dǎo)致一系列細(xì)胞效應(yīng)，如通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，阻止被感染肌細(xì)胞動(dòng)蛋白的聚集和巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的快速重排，從而抑制巨噬細(xì)胞的吞噬；肌動(dòng)蛋白的變構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排、轉(zhuǎn)錄因子的激活、離子通道的刺激、在某些細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；抑制NF-κB和Rho GTP酶的活性，從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡和肌動(dòng)蛋白的分解等，分泌和轉(zhuǎn)移過(guò)程是由非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控的。這些研究結(jié)果對(duì)研制新的抗菌感染藥物和疫苗等策略提供了可能性。Rosenzweig J A等[16]在評(píng)估A.HydrophilaAexU對(duì)小鼠毒性和免疫原性的貢獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)A.hydrophilaΔaexU突變株對(duì)小鼠的致死率明顯下降，并且ΔaexU突變株在被感染的小鼠體內(nèi)不會(huì)擴(kuò)散到肺和脾臟等器官，rAexU 突變株對(duì)小鼠提供保護(hù)性免疫原性，試驗(yàn)結(jié)果為研發(fā)A.Hydrophila疫苗提供了可行性；Xiao J等[64]將E.tardaEIB202突變株WED作為研究對(duì)象，WED是將T3SS的eseB、eseC、eseD基因和分枝酸合成基因aroC缺失，并將內(nèi)源質(zhì)粒pEIB202去掉的菌株。研究發(fā)現(xiàn)WED的半數(shù)致死量是野生株的5700倍；將WED作為疫苗接種到大菱鲆5個(gè)周后，大菱鲆能夠免于E.tardaEIB202野生株毒力因子的作用，產(chǎn)生低水平的特異性抗體和免疫相關(guān)因子，結(jié)果表明WED作為大菱鲆的活體減毒疫苗具有可行性。

目前，依然存在許多亟待解決的問(wèn)題(如鑒定出誘導(dǎo)和抑制T3SS表達(dá)的環(huán)境和宿主信號(hào)因子、解釋效應(yīng)蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用等)，對(duì)于研究T3SS復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，闡明其致病機(jī)理，設(shè)計(jì)針對(duì)T3SS表達(dá)的治療藥物和方法，都具有極其重要的意義。

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Research Progress of Type Ⅲ Secretion System in Common Mariculture Gram-negative Pathogenic Bacterium

DING Xiao-yan1,2, ZHU Peng-fei2, WANG Min-qiang1, QU Ling-yun2*

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai, Shandong 264005; 2. The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao, Shandong 266061)

Many Gram-negative pathogenic bacteria develop their virulence factors or effectors to eukaryotic host cells through their type Ⅲ secretion systems(T3SSs).Vibrioparahaemolyticus,EdwardsiellatardaandAeromonashydrophilaare three common Gram-negative pathogens in marine aquaculture, which not only infect aquaculture animals but also cause gastroenteritis in humans. T3SS are suggested to be closely related to bacteria pathogenicity in these three pathogens. The recent progresses in the composition, function and regulation mechanism study of the T3SSs in those three pathogens were summarized.

Gram-negative pathogens; Type Ⅲ secretion system; Virulence factors

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201105007-1)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD17B01)。

丁曉燕(1990- )，女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原微生物學(xué)研究。

2015-03-23

S 917.1

A

0517-6611(2015)13-156-06