有機酸對牛肉原料表面致病菌的清洗抑制研究

郭 巖，成玉梁，姚衛(wèi)蓉，謝云飛，錢 和

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

有機酸對牛肉原料表面致病菌的清洗抑制研究

郭 巖，成玉梁，姚衛(wèi)蓉，謝云飛，錢 和*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

[目的]篩選對牛肉原料表面致病菌經(jīng)濟有效的有機酸清洗方法。[方法]以降低接種牛肉原料表面致病菌殘留量以及殘留致病菌在4 ℃儲藏期間生長抑制程度為指標，篩選出適宜的有機酸清洗劑種類及濃度。[結(jié)果]試驗得出，1%乳酸對接種牛肉表面致病菌的清洗效果最好，1%乙酸對儲藏期間殘留致病菌的抑制效果最好。[結(jié)論]研究可為牛肉制品生產(chǎn)過程中原料致病菌的控制提供理論指導(dǎo)。

致病菌；有機酸；牛肉原料；清洗；抑制

醬鹵、腌制肉制品等即食食品因其方便美味越來越受到人們的喜愛，但在其加工環(huán)節(jié)，由于缺少有效的清洗措施，在加工滯后時間內(nèi)易受到微生物污染，很容易引起微生物的繁殖，甚至引起食源性疾病，是易發(fā)生食品中毒的“高危食品”[1]。常見的污染微生物有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等食源性致病菌。在我國，大腸桿菌是引起我國居民腹瀉的首要病源[2]；金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛分布，食品污染后不僅腐敗變質(zhì)，還有部分菌株可產(chǎn)生腸毒素[3]；單增李斯特菌在自然界廣泛分布且可以在低溫環(huán)境條件下生長繁殖，人類感染單增李斯特菌的疾病致死率為20%～30%，并有嚴重的臨床癥狀[4]。

研究表明，有機酸可以降低食品中水分的pH，有溶解細菌細胞膜的作用，在防腐抑菌方面應(yīng)用十分廣泛[5]。特別是低分子有機酸能透過微生物細胞膜進入細胞內(nèi)部而離解，改變細胞內(nèi)的電荷分布，導(dǎo)致細胞代謝紊亂或死亡，對多數(shù)細菌均有效[6]。高彩霞等[7]、李清秀等[8]、馬艷麗等[9]也報道了乳酸、乙酸、檸檬酸等常見有機酸對不同載體表面常見致病菌的抑菌作用。但有機酸作為清洗劑對致病菌的清洗及抑菌效果的研究并不多見。

筆者以醬牛肉原料為載體，篩選對接種牛肉原料表面的單核細胞增生李斯特菌(L.mono)、金黃色葡萄球菌(S.aure)與大腸桿菌(E.coli)有較好清洗效果及抑制效果的有機酸，得到一種經(jīng)濟有效低濃度的牛肉原料清洗處理方法，此方法有殘留低的優(yōu)點，從而為從源頭上控制原料中致病菌的污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象。新鮮牛肉黃瓜條，購自江蘇無錫華潤萬家超市；單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，均由江南大學(xué)食品安全與質(zhì)量控制實驗室自分離提供。

1.1.2主要試劑。乳酸(LA)、乳酸鈉、乙酸(AA)、乙酸鈉、檸檬酸(CA)、檸檬酸鈉、雙乙酸鈉(SD)，均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、PALCAM培養(yǎng)基、Baird-Paker瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA，均購自北京路橋技術(shù)有限責任公司。

1.1.3主要儀器。立式圓形壓力蒸汽滅菌器，上海醫(yī)用核子儀器廠；BSC系列生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1有機酸對牛肉原料表面接種致病菌的清洗效果。

1.2.1.1微生物接種液制備。將甘油保藏的單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌與大腸桿菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化并傳代2次，斜面保存于4 ℃冰箱中，使用時用接種環(huán)挑起分別接種到肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，取1 ml離心獲取細胞，用無菌生理鹽水稀釋至108CFU/ml，備用。

1.2.1.2樣品制備及接種。將新鮮的牛肉黃瓜條洗凈，切成5 cm×10 cm，厚2 cm的薄片(兩個側(cè)面的表面積之和為100 cm2)。接種時用無菌玻璃棒向樣品的兩側(cè)表面分別涂抹上述接種液1 ml，涂抹均勻后用經(jīng)酒精消毒的無菌錫紙包裹，4 ℃下放置20 min，使接種液與牛肉充分接觸[10]，牛肉表面的接種濃度為106CFU/cm2。

1.2.1.3有機酸溶液制備與樣品處理。將乳酸、乙酸用蒸餾水分別配制成0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(V/V)的溶液各100 ml(分別加入適量的對應(yīng)鹽類使溶液pH>3.5),檸檬酸、雙乙酸鈉用蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的溶液各100 ml。高溫高壓滅菌(121 ℃，15 min)，冷卻至室溫待用。在無菌條件下，將接種后的牛肉與有機酸溶液同時放入無菌袋中，常溫下輕微振蕩，60 s之后將牛肉迅速取出，瀝水后放入含有50 ml無菌MRD緩沖液(0.1%蛋白胨和8.5%NaCl)的無菌袋中,搖晃30次，使細菌細胞分散[10]。

1.2.1.4致病菌殘留量計數(shù)。取各組緩沖液1 ml分別用無菌生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度，在無菌操作條件下，取0.1 ml表面涂布于PALCAM瓊脂培養(yǎng)基(單增李斯特菌)、Baird-Paker瓊脂培養(yǎng)基(金黃色葡萄球菌)和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA培養(yǎng)基(大腸桿菌)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，分別計數(shù)殘留致病菌數(shù)量(CFU/cm2)，換算成log CFU/cm2。每組3次平行。

1.2.2有機酸清洗牛肉原料后對表面接種致病菌的抑制效果。

1.2.2.1有機酸溶液配制與樣品處理。根據(jù)“1.2.1”的篩選結(jié)果，配制1%(V/V)的乳酸和乙酸溶液(調(diào)pH>3.5)。將配置好的有機酸溶液與蒸餾水對照組高壓滅菌(121 ℃，15 min)，冷卻至室溫。將新鮮的牛肉黃瓜條洗凈，切成5 cm×10 cm，厚2 cm的薄片(兩個側(cè)面的表面積之和為100 cm2)若干，分為3組，每組15個樣品。在無菌條件下將每組處理好的牛肉黃瓜條與清洗液同時放入無菌袋中，常溫下輕微振蕩，60 s之后將牛肉迅速取出，無菌條件下室溫放置20 min。將“1.2.1.1”的接種液用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/ml，將清洗過的牛肉樣品每組分別接種單核細胞增生李斯特菌×5、金黃色葡萄球菌×5及大腸桿菌×5。在無菌操作條件下用無菌玻璃棒分別向樣品的兩側(cè)表面涂抹上述接種液1 ml，使牛肉表面的致病菌數(shù)量為104CFU/cm2。接種完畢放入無菌袋中，4 ℃條件下儲藏。第2天分別將每組的每種致病菌樣品取出一個，放入含有50 ml無菌MRD緩沖液的無菌袋中，搖晃30次，以使細菌細胞分散。此后每隔1周取樣重復(fù)上述步驟[11]。

1.2.2.2殘留致病菌數(shù)量計數(shù)。將各組緩沖液用無菌生理鹽水梯度稀釋至適宜濃度，在無菌操作條件下，表面涂布于各個選擇性培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，分別計數(shù)(CFU/cm2)，換算成log CFU/cm2。每組3次平行，得到4 ℃儲藏條件下殘留致病菌的生長抑制曲線。

1.2.3數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行方差分析和顯著性差異檢驗，用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸對接種牛肉原料致病菌的清洗效果

2.1.1單增李斯特菌的清洗效果。從圖1可以看出，隨著有機酸濃度的增大，單增菌的殘留量呈下降趨勢，濃度變化到1.0%時，下降的趨勢較明顯，濃度再增大時，下降趨勢變的平緩。從有機酸的類型來看，乳酸清洗效果最好，乙酸次之，雙乙酸鈉與乙酸清洗效果相當，檸檬酸對單增菌的清除能力最弱?？紤]到工廠實際操作的經(jīng)濟適用原則及GB2760中有關(guān)雙乙酸鈉添加限量的規(guī)定，1.0%(V/V)的乳酸為適宜的清洗劑。

2.1.2金黃色葡萄球菌的清洗效果。由圖2可知，隨有機酸溶液濃度的增大，金黃色葡萄球菌的殘留量整體呈下降趨勢。就有機酸的種類來說，清洗效果最好的仍是乳酸和乙酸，1.0%乳酸清洗時殘留量達到最低值，1.5%乙酸清洗時殘留量達到最低值，此后的趨勢逐漸變緩。因此，1.0%乳酸為適宜清洗劑。

2.1.3大腸桿菌的清洗效果。從圖3可以看出，隨有機酸濃度的增大，大腸桿菌的殘留量呈整體下降趨勢。乳酸與乙酸的清洗效果在1.0%處達到最佳值，檸檬酸與雙乙酸鈉在2.0%處達到最低值。就殘留量來說，乳酸與乙酸的清洗效果遠優(yōu)于檸檬酸與雙乙酸鈉，并且在較低濃度時就可以達到較好的請效果，故1.0%乳酸為適宜清洗劑。

2.1.4最適清洗劑及其濃度的確定。從表1可以看出，初始接種量為6 log CFU/cm2，對照組的致病菌殘留量在5.3 log CFU/cm2左右，表明蒸餾水的物理移除清洗效果為0.7 log CFU/cm2。與蒸餾水對照組相比，1.0%乳酸可將單增李斯特菌的殘留量降低0.789 log CFU/cm2，與對照組及其他酸洗組的單增李斯特菌殘留量相比均有顯著性差異(P<0.05)，1.0%乙酸組與對照組及1.0%檸檬酸組的單增李斯特菌殘留量相比也均呈顯著性差異(P<0.05)，但與1.0%雙乙酸鈉組單增菌殘留量相比無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，1.0%乳酸可將金黃色葡萄球菌殘留量降低1.217 log CFU/cm2，而其他有機酸組與對照組相比金葡菌殘留量的數(shù)量降低均小于1 log CFU/cm2。1.0%乳酸對金黃色葡萄球菌的清洗效果與其他組相比差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，1.0%乳酸將大腸桿菌殘留量降低了1 log CFU/cm2，下降幅度大于其他有機酸組，且1.0%乳酸組對大腸桿菌的清洗效果與對照組及其他有機酸組相比效果顯著(P<0.05)。驗證了Ga-Hee Ban等的研究結(jié)果[12]。由此可知，有機酸對致病菌的清洗效果為乳酸>乙酸>雙乙酸鈉>檸檬酸，1.0%的乳酸和1.0%乙酸為適宜的牛肉原料清洗劑，能較好地降低接種牛肉原料表面的致病菌殘留量。

表1 蒸餾水、1.0%乳酸、1.0%乙酸、1.0%雙乙酸鈉和1.0%檸檬酸清洗接種牛肉原料表面單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殘留量

清洗方式病原菌殘留量∥logCFU/cm2單增李斯特菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌綜合效果logCFU/cm2蒸餾水5.2045.4475.3425.3311.0%乳酸4.4154.2304.3424.3291.0%乙酸4.7084.6024.4914.6001.0%檸檬酸4.9295.0094.9144.9511.0%雙乙酸鈉4.6904.9195.0414.883

2.2 1.0%乳酸和1.0%乙酸清洗牛肉原料后對表面接種致病菌的抑制效果

2.2.1單增李斯特菌的抑制效果。由圖4可以看出，蒸餾水清洗的對照組(CK)在儲藏的最初2周內(nèi)，單增李斯特菌的數(shù)量增加了3.163 log CFU/cm2。而酸洗組對殘留單增菌的生長有一定的抑制作用，其中1.0%乙酸組在4周內(nèi)單增菌數(shù)量只增加了0.582 log CFU/cm2，與對照組及1.0%乳酸組相比抑制效果顯著(P<0.05)。而1.0%乳酸組雖有抑制作用但抑制效果與對照組相比不顯著(P>0.05)。故1.0%乙酸對單增李斯特菌的抑制效果優(yōu)于1.0%乳酸。

2.2.2金黃色葡萄球菌的抑制效果。圖5表明，對照組(CK)在儲藏期間金黃色葡萄球菌的數(shù)量增加了3.361 log CFU/cm2。酸洗組與對照組相比，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但與對照組相比，1.0%乙酸的抑制效果不顯著(P=0.073)。在儲藏期間，1.0%乙酸組金黃色葡萄球菌的數(shù)量增加了1.339 log CFU/cm2，1.0%乳酸組金黃色葡萄球菌的數(shù)量則增加了2.174 log CFU/cm2。故乙酸對金黃色葡萄球菌的抑制效果仍優(yōu)于乳酸。

2.2.3大腸桿菌的抑制效果。圖6表明，對照組(CK)在儲藏期間，大腸桿菌的數(shù)量增加了2.239 log CFU/cm2。1.0%乙酸組在儲藏最初2周內(nèi)大腸桿菌數(shù)量增加了0.222 log CFU/cm2，隨后數(shù)量減少至3.491 log CFU/cm2，低于初始水平，與對照組和1.0%乳酸組相比，對大腸桿菌的抑制效果很顯著(P<0.05)。1.0%乳酸組的抑制效果與對照組相比不顯著(P>0.05)。故乙酸對大腸桿菌的抑制效果優(yōu)于乳酸。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，對于牛肉原料表面接種的單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(106CFU/cm2),1.0%乳酸的清洗效果最好，與初始接種量相比可將致病菌殘留量減少約2.0 Log CFU/cm2，與蒸餾水清洗相比可將致病菌殘留數(shù)量降低約1.3 Log CFU/cm2。這可能是因為乳酸有較大的有效酸度[13]。對有機酸清洗后的牛肉原料表面接種致病菌(104CFU/cm2)，4 ℃條件下儲藏，可以看出1.0%乙酸的抑菌效果最好。乙酸的酸性低于乳酸，其抑菌效果優(yōu)于乳酸的原因可能是不同的酸性陰離子抑菌能力不同，有機酸對致病菌的抑制效果不僅僅取決于其儲藏過程中殘留的有效酸度，還與外部環(huán)境以及細菌對酸性陰離子的抗性不同等多種因素有關(guān)[14]。

牛肉制品加工過程中，原料致病菌的干預(yù)措施應(yīng)將有機酸清洗與蒸汽殺菌、熱水殺菌等方法結(jié)合起來，起到協(xié)同作用，可以更持續(xù)有效地控制原料牛肉的致病菌數(shù)量。

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Efficacy of Washing Beef Surface With Organic Acids for Pathogen Decontamination and Residual Growth Inhibition

GUO Yan, CHENG Yu-liang, YAO Wei-rong, QIAN He*et al

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The paper aims to filter the cost effective organic acid cleaning method for pathogen on beef surface. [Method] We compared the decontamination and residual growth inhibition of 4 organic acids with different concentration and select the suitable type and concentration. [Result] 1% lactic acid is optimum for pathogen decontamination and 1% acetic acid is optimum for pathogen residues growth inhibition during the 4 ℃ storage condition. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for raw materials pathogen control during the production process.

Pathogen; Organic acid; Raw material; Decontamination; Inhibition

國家“十二五”科技支撐計劃(2014BAD04B03)。

郭巖(1991-)，女，山西運城人，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。*通訊作者，教授，博士，從事食品安全與質(zhì)量控制研究。

2015-03-23

S 851.34+7.1

A

0517-6611(2015)13-267-03