某院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌多位點(diǎn)序列分型研究

潘軍，許青霞，肖偉強(qiáng)，常彥敏，沈勇

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州450008)

某院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌多位點(diǎn)序列分型研究

潘軍，許青霞，肖偉強(qiáng)，常彥敏，沈勇

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州450008)

目的了解鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院臨床和環(huán)境中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌多位點(diǎn)序列分型(MLST)及其遺傳進(jìn)化關(guān)系，為監(jiān)測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株的流行和醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。方法采用基因擴(kuò)增和測(cè)序的方法對(duì)26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌7個(gè)管家基因進(jìn)行序列分析，并與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到每個(gè)菌株相應(yīng)的等位基因號(hào)。結(jié)果26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌獲得16種序列分型(ST)，其中3株為ST69型、3株為ST131型。結(jié)論產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌遺傳背景多樣化，ST131型和ST69型為本研究主要型別，其它型別散在分布。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;大腸埃希菌;多位點(diǎn)序列分型

大腸埃希菌是腸道內(nèi)大量存在的正常菌群，但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌引起腸道外感染。近年來(lái)，由于大量使用抗菌藥物以及耐藥質(zhì)粒相互傳遞，造成耐藥菌株明顯增加，引起醫(yī)院內(nèi)感染呈上升趨勢(shì)。

多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是近年來(lái)發(fā)展很快的分子生物學(xué)分析方法［1-4］，具有很高的分辨能力，以7個(gè)管家基因?yàn)榛A(chǔ)，具有相對(duì)變化緩慢的突變積累效應(yīng)，結(jié)果以序列分型(sequence type，ST)表示，不同的菌株對(duì)應(yīng)不同的ST，從而可對(duì)菌株的等位基因進(jìn)行多樣性比較。MLST既適于分子流行病學(xué)研究，也可用于分子進(jìn)化學(xué)研究。因此我們對(duì)分離到的26株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase，ESBLs)大腸埃希菌進(jìn)行MLST研究。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

收集各種臨床和環(huán)境樣本中分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌26株。采用法國(guó)生物梅里埃公司的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK 2及配套的革蘭陰性菌GN卡進(jìn)行鑒定。經(jīng)分離鑒定確定為大腸埃希菌，菌株于甘油保存管中-20℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)，來(lái)自中國(guó)菌種保存中心。

二、試劑與儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)帶(100～2 000 bp) (上海生工生物工程有限公司)、試驗(yàn)所用引物(上海生工生物工程有限公司)、Premix Taq酶(大連寶生物工程有限公司)、GeneAmp9700聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)、Alpha凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、ABI 3730測(cè)序儀(上海生工生物工程有限公司)。

三、ESBLs的表型確認(rèn)試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的推薦方法:血瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇冰凍保存菌株，挑取單個(gè)菌落于無(wú)菌生理鹽水中調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，涂抹在水解酪蛋白胨平板上，待干后貼加頭孢他啶(30 μg)/頭孢他啶-克拉維酸(30/10 μg)和頭孢噻肟(30 μg)/頭孢噻肟-克拉維酸(30/10 μg)2組藥物敏感性紙片，其中任何一組抑菌圈直徑增大≥5 mm時(shí)，則判為產(chǎn)ESBLs菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)。

四、DNA模板提取

從35℃過(guò)夜培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落4～8個(gè)，然后按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，-20℃保存。

五、MLST

選擇大腸埃希菌的7個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)作為目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列參考文獻(xiàn)［5］合成，見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性2 min;然后95℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，由上海生工生物工程有限公司用ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果拼接后提交網(wǎng)站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/ Ecoli)進(jìn)行比對(duì)分析，得到相應(yīng)的ST，數(shù)據(jù)庫(kù)中不能完全比對(duì)的，確認(rèn)為新的ST。新的等位基因序列、ST和菌株資料均遞交至網(wǎng)站(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/documents/submission_htm l)。

六、數(shù)據(jù)分析

采用網(wǎng)絡(luò)軟件“http://pubmlst.org/ analysis/”對(duì)MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建Splits Tree進(jìn)化關(guān)系樹(shù)。

表1 7個(gè)管家基因引物序列及退火溫度［1］

結(jié)果

一、體外藥物敏感性試驗(yàn)

26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中17株來(lái)源于引流液、血液、中段尿、膿液和痰液等臨床樣本，9株來(lái)自環(huán)境或正常部位包括患者手、陪護(hù)手、床把手、床頭柜、門和大便。26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)亞胺培南、美羅培南的敏感率為100%，未出現(xiàn)耐藥株;對(duì)阿莫西林-克拉維酸的敏感率僅為28%，對(duì)頭孢類抗菌藥物的耐藥率為100%，對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率為70%左右，對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因的敏感率較高，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥。

二、7個(gè)管家基因PCR擴(kuò)增

將26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的7個(gè)管家基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到7個(gè)管家基因預(yù)期片段長(zhǎng)度583～932 bp。MLST 7個(gè)管家基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1。

三、MLST

對(duì)26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌7個(gè)管家基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果提交網(wǎng)站與對(duì)應(yīng)基因的等位基因譜(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)比對(duì)得到每個(gè)菌株等位基因號(hào)，獲得16種不同的ST，其中ST405型2株、ST2179型2株、ST167型2株、ST10型2株、ST69型3株、ST38型2株、ST2003型2株、ST131型3株，其余為不同的ST，其中17株來(lái)自臨床感染病例產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，9株來(lái)自環(huán)境或正常部位產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。MLST結(jié)果見(jiàn)表2、表3。對(duì)26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MLST的結(jié)果采用SplitsTree軟件進(jìn)行無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示ST呈現(xiàn)散在分布。依據(jù)SplitsTree進(jìn)化關(guān)系圖所示，ST38型和ST2003型屬于同一分支，ST167型和ST10型屬于同一分支，具有較近的親緣關(guān)系。見(jiàn)圖2。

圖1 MLST 7個(gè)管家基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表2 17株臨床感染病例產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MLST結(jié)果

表3 9株環(huán)境或正常部位產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MLST結(jié)果

圖2 大腸埃希菌MLST SplitsTree進(jìn)化關(guān)系圖

討論

MLST是一個(gè)具有高分辨率的分子生物學(xué)方法［1-4］，克服了脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型的不足。由于大腸埃希菌的基因具有高度一致性，管家基因的進(jìn)化非常慢，多態(tài)性位點(diǎn)較少。由于其中任何一個(gè)管家基因都有許多等位基因，菌株間有相同等位基因譜的可能性極小。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)對(duì)不同地區(qū)分離的菌株進(jìn)行等位基因比較，由此得到的結(jié)果在世界各地實(shí)驗(yàn)室之間具有可比性，可以追蹤菌株間的遺傳關(guān)系和進(jìn)化過(guò)程，進(jìn)行群體進(jìn)化研究和分子流行病學(xué)研究。

本研究MLST結(jié)果顯示，26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌共分為16種不同的ST，其中ST405型2株、ST2179型2株、ST167型2株、ST10型2株、ST69型3株、ST38型2株、ST2003型2株、ST131型3株，其余為不同的ST。ST為散在分布，其中ST38(4-26-2-25-5-5-19)和ST2003(4-26-2-25-4-5-19)僅管家基因mdh不同，ST167(10-11-4-8-8-13-2)和ST10(10-11-4-8-8-8-2)僅管家基因purA有差別，用SplitsTree軟件分析ST167和ST10均屬于克隆復(fù)合體CC10，提示來(lái)源于不同科室的菌株其遺傳背景呈多樣化。潘偉光等［6］對(duì)廣東地區(qū)27株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行了MLST分析，發(fā)現(xiàn)8種不同的ST，ST38型4株和ST131型4株相對(duì)集中，其余型別為散在分布。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符。ZHANG等［7］對(duì)中國(guó)西部地區(qū)20家醫(yī)院分離的144株大腸埃希菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)8株產(chǎn)CTX-M-15酶，其中ST131型3株，另外5株是新的ST型別(ST3342、ST3513、ST3516、ST3517和ST3518)。欲進(jìn)一步了解河南地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的流行情況，還需增加醫(yī)院和菌株數(shù)量進(jìn)行深入分析研究，但短期內(nèi)無(wú)法再收集到符合條件的菌株，實(shí)驗(yàn)例數(shù)無(wú)法增加，這是本研究的不足之處。

多重耐藥大腸埃希菌最主要的流行克隆株是ST131克隆株，目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)ST131克隆株在全世界范圍內(nèi)流行。這種克隆株的特征是產(chǎn)CTX-M-15酶，屬于B2進(jìn)化亞群，大多數(shù)菌株表現(xiàn)為血清型O25b:H4，MLST為ST131，即產(chǎn)CTX-M-15型O25b:H4-B2-ST131克隆株［8-10］。此種克隆株攜帶高致病性腸外毒素，容易引起尿路感染、菌血癥和新生兒血流感染［11］。而ST405、ST648、ST10、ST38已成為其他最常見(jiàn)的ST。據(jù)報(bào)道在南美已經(jīng)有大腸埃希菌ST131和ST405引起社區(qū)發(fā)生的感染［12］。ST405克隆株已參與傳播基因編碼CTX-M酶、AmpC β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶或甲基化酶(AmrA，RmtB)［13-14］。最近的研究報(bào)道ST69和ST405在產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs之間某一特定的位置發(fā)生變異［15］。另有報(bào)道稱ST648已經(jīng)從人類或家禽中產(chǎn)CTX-M型ESBLs大腸埃希菌中分離到［16-18］。本研究中也有這些型別的菌株，說(shuō)明在中國(guó)中部地區(qū)也可能存在此種流行克隆株。

本研究16種不同的ST中相對(duì)集中的是3株ST131，來(lái)源于胸二病區(qū)床頭柜和門以及患者痰液樣本，很可能由于患者感染的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌污染周圍環(huán)境，在住院患者陪護(hù)人員手、病房門把手、床把手及床頭柜均分離出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，且ST相同屬于同一克隆株。這些因素均可造成產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在患者與患者之間傳播，導(dǎo)致醫(yī)院感染的發(fā)生。提示ST131可能是該病區(qū)流行的克隆菌株，需要進(jìn)一步研究分析確認(rèn)是否為ST131型克隆株的傳播。另外，本研究醫(yī)院環(huán)境中也檢測(cè)到ST167、ST410、ST2003、ST10、ST131 5種型別，呈散在分布。

藥物敏感性資料顯示，26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)亞胺培南、美羅培南敏感性較高，未出現(xiàn)耐碳青霉烯酶的大腸埃希菌。對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因耐藥率較低。對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率較高，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥，應(yīng)引起臨床高度重視。

產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌是醫(yī)院感染的常見(jiàn)耐藥菌之一，可長(zhǎng)期潛伏在醫(yī)院環(huán)境中，通過(guò)各種途徑在各科室之間相互傳播，隨時(shí)引起醫(yī)院感染，造成耐藥菌株院內(nèi)流行。因此，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染易感因素控制及耐藥監(jiān)測(cè)，重視病房消毒隔離工作和加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員管理，切斷各種感染途徑，有效預(yù)防和控制醫(yī)院感染的發(fā)生。

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M ultilocus sequence typing study of ESBLs-producing Escherichia coli in one hospital

PAN Jun，XU Qingxia，XIAO Weiqiang，CHANG Yanmin，SHEN Yong.(Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Henan Zhengzhou 450008，China)

ObjectiveTo investigate the multilocus sequence typing(MLST)and genetic evolution of extendedspectrum beta-lactamase(ESBLs)-producingEscherichia coliin the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，and to provide the reference for the monitoring of ESBLs-producing isolates＇epidemic and hospital infection control.MethodsGene amplification and sequence analysis were performed for 7 housekeeping genes of 26 isolates of ESBLsproducingEscherichia coli，and alleles were compared with those assigned at MLST databases.ResultsA total of 16 sequence types(ST)were obtained in the 26 isolates of ESBLs-producingEscherichia coli，in which there were 3 ST69 and 3 ST131.ConclusionsESBLs-producing Escherichia coli has diversified genetic backgrounds，and ST131 and ST69 are the most prevalent types，while other types were scattered.

Extended-spectrum beta-lactamase;Escherichia coli;Multilocus sequence typing

1673-8640(2015)09-0939-05

R378.2

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.017

2014-10-08)

(本文編輯:姜敏)

河南省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(112102310256)

潘軍，女，1983年生，碩士，主管技師，主要從事臨床微生物與細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

許青霞，聯(lián)系電話:0371-65587147。