微小脲原體相對定量方法的建立及臨床應用

趙縝，劉璐，趙芳，曹國君，黃燕群，季育華

(1.上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海201199; 2.上海市閔行中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海201199; 3.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025)

微小脲原體相對定量方法的建立及臨床應用

趙縝1，劉璐2，趙芳1，曹國君1，黃燕群2，季育華3

(1.上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海201199; 2.上海市閔行中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海201199; 3.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025)

目的建立微小脲原體(Up)聚合酶鏈反應(PCR)相對定量方法，克服陰道標本采樣差異對檢測結(jié)果的影響，并探討Up在細菌性陰道病(BV)中的作用。方法根據(jù)Up 4個血清型拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因序列，合成Up定量PCR的引物和探針，建立Up PCR定量方法;同時進行宿主細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因定量，計算103宿主細胞中Up的相對含量;分別檢測Up標準株和臨床分離株、解脲脲原體標準株和臨床分離株、11種其它陰道常見微生物，驗證PCR的特異性;從532例BV患者和276名健康女性采集陰道分泌物，進行Up相對定量分析。結(jié)果Up定量PCR方法能直接檢測陰道分泌物中的Up，對解脲脲原體和11種其它陰道常見微生物無交叉反應，靈敏度為100拷貝/μL。BV患者和健康女性的Up感染率分別為49.8%(265/532)和43.1%(119/276)，二者之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.263，P=0.071);BV患者和健康女性Up相對定量分別為667拷貝/103細胞和20拷貝/103細胞，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=47.012，P=0.000 1)。如果以50拷貝/103細胞作為參考值，則BV患者Up的陽性率為39.3%(209/532)，健康女性的陽性率為17.0%(47/276)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 41.537，P=0.001)。結(jié)論Up黏附到宿主細胞表面是其致病的關鍵因素。建立的Up相對定量方法能反映宿主細胞上Up的含量，克服了采樣差異對檢測結(jié)果的影響，能更客觀地反映Up的致病能力。

微小脲原體;PCR相對定量分析;細菌性陰道病

脲原體是引起人類泌尿生殖道感染的常見病原體之一，包括2個生物群，14個血清型。生物一群即微小脲原體(Ureaplasma parvum，Up)包括基因組較小的4個血清型(1、3、6和14)，約占脲原體感染的90%;生物二群即解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)，包括其余基因組較大的10個血清型，約占脲原體感染的10%。脲原體血清分型方法包括抗原檢測法和抗體檢測法?？乖瓩z測法主要有間接免疫熒光試驗、間接免疫酶標試驗、斑點雜交試驗等;抗體測定法主要有代謝抑制試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。這些方法均具有較高的敏感性，但由于不同血清型之間存在交叉反應而影響了檢測的特異性［1-2］。

最近，劉璐等［3］根據(jù)拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因序列差異建立了Up定性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法。與培養(yǎng)法比較，PCR具有更高的敏感性和特異性。由于泌尿生殖道標本檢測易受采樣量的影響，所以目前尚無準確的定量方法。我們在前期工作的基礎上制備PCR檢測的標準品，建立了Up實時熒光定量PCR方法。為了避免標本采樣量差異對檢測結(jié)果的影響，我們參考人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的定量方法［4-5］，在進行Up PCR定量檢測的基礎上，同時進行宿主細胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因的定量檢測，然后計算103個宿主細胞所含Up的數(shù)量［6］，實現(xiàn)了Up的相對定量分析，并用于細菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)患者的檢測。

材料和方法

一、研究對象

2011年10月至2012年2月上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診者3 062例，分別收集陰道分泌物標本(3份/人)。1份鏡檢后染色用于BV的診斷，同時排除滴蟲、真菌、淋球菌感染。BV診斷采用Nugent計分法:0～3為陰性，7～10為陽性。1份用于培養(yǎng)，排除大腸桿菌、鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、人型支原體等感染;另1份-80℃凍存，用于PCR分析。最后篩選出908例，其中健康對照(無BV和陰道炎)276名，BV患者532例。

二、實驗用菌株

標準菌株包括Up(serovar 1，ATCC 27813)、Uu(serovar 4，ATCC27816)、白念珠菌(ATCC 90028)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、糞腸球菌(ATCC29212);臨床分離株包括12株Uu(經(jīng)測序鑒定)［3］、38株Up(經(jīng)測序鑒定)［3］、加德納菌、乳酸桿菌、脆弱擬桿菌、彎曲短桿菌、人型支原體。

三、儀器和試劑

陰道拭子和支原體分離培養(yǎng)試劑盒購于珠海麗珠試劑股份有限公司。PCR擴增試劑購于TaKaRa公司。ABI 7300實時熒光定量PCR擴增儀;Tanon EPS-300型瓊脂糖凝膠電泳儀;Tanon 2500型凝膠成像儀;Eppendorf 5804R型臺式高速離心機。

四、PCR定量方法

Up DNA提取及PCR擴增的引物、探針、擴增條件均參考文獻［3］。PCR定量擴增片段大小為146 bp，探針5＇端標記羥基熒光素(carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)，3＇端標記羧基四甲基羅丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)。在定量擴增基因片段的上游和下游分別設計引物，引物的5＇端分別含有HindⅢ與BamHⅠ酶切位點，用于擴增PCR定量分析標準品(602 bp)，建立標準曲線。引物和探針均由Invitrogen公司合成，見表1。

表1 Up PCR定量分析的引物和探針

PCR反應體系:10×PCR緩沖液5 μL，Taq酶2.5 U，dNTP 0.8 mmol/L，Mg2+4.5 mmol/L，引物各0.2 μmol/L，Uu、Up探針各0.18 μmol/L，模板2.0 μL，加去離子水至50 μL。PCR反應條件: 94℃預變性4 min;94℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。PCR擴增的標準品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化、酶切、連接到GFP質(zhì)粒中，經(jīng)PCR擴增并雙向測序鑒定，然后分別稀釋到106、105、104、103、102拷貝/μL，用作定量PCR擴增時的標準品，建立標準曲線。陽性對照:Up(serovar 1)培養(yǎng)后抽提DNA。陰性對照:去離子水。

五、Up相對定量分析

人GAPDH熒光定量PCR檢測試劑盒購自ABI公司。GAPDH基因作為內(nèi)參對陰道分泌物標本中的細胞進行定量分析，陰性標本排除研究，陽性標本進行Up相對定量分析，即BL=QU/QGAPDH×103，式中BL代表103個宿主細胞所含的Up量，Qu代表標本中Up的基因拷貝數(shù)，QGAPDH代表標本中GAPDH的基因拷貝數(shù)［4-6］。來自健康對照者和BV患者的陰道拭子均抽提DNA，然后進行Up和GAPDH PCR定量分析，每次檢測均設置標準曲線、陰性對照(無菌水)和陽性對照［Up(serovar 1)標準株］。

六、統(tǒng)計學方法

采用SAS 6.12軟件進行統(tǒng)計分析。BV患者和健康人群的Up陽性率比較采用χ2檢驗，PCR相對定量數(shù)據(jù)的比較采用秩和檢驗［4-6］。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、Up PCR定量方法的建立

含有Up拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因片段的GFP質(zhì)粒經(jīng)相應引物(針對標準品的引物)擴增、電泳后在602 bp處出現(xiàn)清晰條帶，見圖1。該擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序，并在NCBI/BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行比對，證實為目的片段。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋后作為標準品，經(jīng)PCR擴增后均出現(xiàn)特異性曲線，間隔均勻，R2為0.997 6，見圖2。

二、Up PCR定量方法的特異性和敏感性

用建立的Up PCR定量方法分別檢測Up (serovar 1)、Uu(serovar 4)、白念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、糞腸球菌、加德納菌、乳酸桿菌、脆弱擬桿菌、彎曲短桿菌、人型支原體。結(jié)果僅有Up(serovar 1)出現(xiàn)特異性擴增曲線，其余菌株均未出現(xiàn)特異性曲線，見圖3。另外，本實驗室保存的38株Up臨床分離株經(jīng)Up PCR定量分析全部擴增出特異性曲線;12例Uu臨床分離株經(jīng)Up PCR定量分析未見特異性曲線。Up標準品經(jīng)系列稀釋后進行PCR定量分析，其檢測靈敏度為100拷貝/μL。

圖1 Up標準品經(jīng)PCR擴增后的電泳圖

圖2 Up PCR定量分析的標準曲線

三、Up在BV患者和健康人群中的感染率

Up PCR定量結(jié)果＞100拷貝/μL為Up陽性。532例BV患者中Up陽性265例(49.8%)、陰性267例(50.2%);276例健康人群中Up陽性119例(43.1%)、陰性157例(56.9%)。2個組之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.263，P=0.071)。

圖3 Up PCR定量方法的特異性和靈敏度

四、BV患者和健康人群中Up的定量分析

標本經(jīng)Up PCR定量檢測和GAPDH PCR定量檢測，然后計算Up的相對含量，結(jié)果用四分位間距表示，即最小值、上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)和最大值［4-6］。BV患者中Up陽性標本的中位數(shù)為667拷貝/103細胞，健康人群中Up陽性標本的中位數(shù)為20拷貝/103細胞，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=47.012，P=0.000 1)，見圖4。如果以50拷貝/103細胞作為參考值［6］，則BV患者的Up陽性率為39.3%(209/532)，健康女性的陽性率為17.0%(47/276)，2個組之間差異有統(tǒng)計學意義(危險度為2.307;95%可信區(qū)間:1.789～2.975;χ2=41.537，P=0.001)。

圖4 Up在BV患者和健康人群中的相對定量分析

討論

Up是女性下生殖道常見的寄生菌之一。由于體積微小、生長條件苛刻以及不同血清型之間存在交叉反應，致使Up檢測比較困難，其致病性也一直存在著爭議。盡管傳統(tǒng)的培養(yǎng)法是Up診斷的“金標準”，但由于易受標本中其它細菌和干擾物質(zhì)的抑制作用，影響了Up的生長，敏感性較低［6-7］。劉璐等［3］根據(jù)Up拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因序列設引物和探針，建立了Up PCR定性分析，該方法與培養(yǎng)法比較具有更高的敏感性和特異性［3］。但由于下生殖道標本采樣量的差異，導致Up很難準確定量。本研究在Up定性方法的基礎上，構(gòu)建標準品，設立標準曲線，建立了Up熒光定量PCR方法，該方法具有高度的特異性，對其它陰道常見微生物沒有擴增，敏感度達到100拷貝/μL。為了校正標本采樣變異對Up定量結(jié)果的影響，本研究同時進行GAPDH PCR定量檢測，結(jié)果顯示陰性的標本為采樣不合格或者存在PCR擴增抑制，被排除實驗研究［6-7］。GAPDH陽性的標本則進行相對定量分析，即計算103個宿主細胞所含的Up量。這樣既排除了Up PCR定量分析中的假陰性標本，也有效校正了標本采樣變異對檢測結(jié)果的影響。

Up的致病機理包括侵襲作用、炎癥誘導、免疫抑制等。(1)侵襲作用:Up能合成多種酶(IgA蛋白酶、磷脂酶A、磷脂酶C等)，破壞天然黏膜屏障，侵入黏膜下層，黏附到上皮細胞并增殖形成微菌落，破壞細胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，引起細胞死亡。(2)炎癥誘導:Up細胞膜中含有豐富的脂蛋白稱為脂質(zhì)相關膜蛋白，它們可以增強宿主細胞表面的Toll受體表達，并與這些受體結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)信號途徑，誘導細胞分泌防御素5、白細胞介素-6、白細胞介素-8和腫瘤壞死因子α，引起炎癥反應。(3)免疫抑制:人急性單核細胞白血病細胞株(THP1)能夠合成抗菌肽，這些抗菌肽對Up具有抑制作用。當Up與THP-1細胞共同培養(yǎng)時，Up可以黏附于THP-1細胞，調(diào)節(jié)細胞染色體的修飾過程，抑制抗菌肽相關基因的表達。這可能是Up逃避宿主細胞天然免疫，引起慢性感染的原因之一［8-9］?？梢?，Up黏附到宿主細胞并在細胞膜上增殖是其致病的關鍵因素。因此，計算單位宿主細胞上Up的含量非常必要。

BV是育齡婦女最常見的下生殖道感染之一，以陰道菌群失調(diào)為特征，表現(xiàn)為正常菌群(產(chǎn)H2O2的乳酸桿菌)數(shù)量減少，代之以陰道加德納菌、普氏桿菌、動彎桿菌、類桿菌等厭氧菌數(shù)量的增加［10］。除了局部感染和不適，BV還可引起上生殖道感染，導致盆腔炎、早產(chǎn)、流產(chǎn)或不育。但由于常用的BV診斷實驗很難檢測到Up，致使其致病性一直存在爭議。本研究用Up相對定量方法對532例BV患者和276名健康女性進行陰道分泌物檢測，發(fā)現(xiàn)盡管Up感染率在2個組之間無明顯差異(P＞0.05)，但定量結(jié)果顯示BV患者Up相對含量明顯高于健康女性(P＜0.05)。而且隨著Up含量的增加，BV發(fā)生的危險度也顯著增加(P＜0.05)。最近，CHAIM等［11］對產(chǎn)后盆腔炎患者和健康產(chǎn)婦分別采集宮頸分泌物并進行脲原體培養(yǎng)，結(jié)果顯示盡管脲原體的感染率在2個組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但產(chǎn)后盆腔炎患者脲原體含量顯著升高(P＜0.05)。不過該研究沒有區(qū)分Up和Uu，也沒有校正標本采集變異對檢測結(jié)果的影響。REYES等［12］在小鼠膀胱內(nèi)分別注入不同濃度的Up培養(yǎng)物，2周后發(fā)現(xiàn)其尿路感染的發(fā)生率與注入的Up濃度有關。其它動物實驗也發(fā)現(xiàn)Up能夠影響感染細胞的移行、變異和凋亡，而疾病的發(fā)展程度可能決定于Up的含量，同時也受宿主細胞免疫的限制。因此，Up準確的定量分析對于研究其致病性可能起到重要作用。

總之，本研究建立了Up相對定量方法，它既能檢測宿主細胞上Up的含量，又克服了陰道分泌物采樣變異對檢測結(jié)果的影響，保證了檢測結(jié)果的準確性，這將為研究Up的致病性提供重要的幫助。

［1］VANCUTSEM E，ECHAHIDI F，VAN GEEL K，et al.Production of recombinant antigens of ureap lasma parvum serotypes 3 and 6 for development of a serological assay［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15(3):447-451.

［2］張曉華，韓冬芳，張晨，等.女性泌尿生殖道解脲支原體基因分型的研究［J］.中國婦幼健康研究，2007，18(2):155-158.

［3］劉璐，季育華，趙縝，等.parC檢測在解脲支原體基因分型中的臨床應用［J］.中華微生物學與免疫學雜志，2011，31(9):843-846.

［4］SAUNIER M，MONNIER-BENOIT S，MAUNY F，et al.Analysis of human papillomavirus type 16 (HPV16)DNA load and physical state for identification of HPV16-infected women with highgrade lesions or cervical carcinoma［J］.J Clin Microbiol，2008，46(11):3678-3685.

［5］BARON C，HENRY M，TAMALET C，et al.Relationship between HPV 16，18，31，33，45 DNA detection and quantitation and E6/E7 mRNA detection among a series of cervical specimens with various degrees of histological lesions［J］.J Med Virol，2015，87(8):1389-1396.

［6］LIU L，CAO G，ZHAO Z，et al.High bacterial loads of ureaplasma may be associated with non-specific cervicitis［J］.Scand J Infect Dis，2014，46(9): 637-641.

［7］XIAO L，GLASS JI，PARALANOV V，et al.Detection and characterization of human ureaplasma species and serovars by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2010，48(8):2715-2723.

［8］TRIANTAFILOU M，DE GLANVILLE B，ABOKLAISH AF，et al.Synergic activation of toll-like receptor(TLR)2/6 and 9 in response to ureaplasma parvum＆urealyticum in human amniotic epithelial cells［J］.PLoS One，2013，8(4):e61199.

［9］XIAO L，CRABB DM，DAI Y，et al.Suppression of antimicrobial peptide expression by ureaplasma species［J］.Infect Immun，2014，82(4):1657-1665.

［10］馮長海，周小龍，王薛峰，等.解脲脲原體性陰道病中Nugent評分的應用及影響因素［J］.檢驗醫(yī)學，2011，26(9):586-588.

［11］CHAIM W，HOROWITZ S，DAVID JB，et al.Ureaplasma urealyticum in the development of postpartum endometritis［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2003，109(2):145-148.

［12］REYES L，REINHARD M，BROWM MB.Different inflammatory responses are associated with ureaplasma parvum-induced UTI and urolith formation［J］.BMC Infect Dis，2009，9:9.

(本文編輯:范基農(nóng))

更正

本刊2015年第30卷第5期第512頁“作者簡介”下應增加“通訊作者:許蕾，聯(lián)系電話:021-68316300-2209?！?，特此更正。

The estab lishment and clinical application of Ureaplasma parvum relative quantitative assay

ZHAO Zhen1，LIU Lu2，ZHAO Fang1，CAO Guojun1，HUANG Yanqun2，JI Yuhua3.(1.Department of Clinical Laboratory，Minhang Central Hospital，Shanghai 201199，China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics，Minhang Central Hospital，Shanghai 201199，China;3.Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China)

ObjectiveTo establish Ureaplasma parvum(Up)polymerase chain reaction(PCR)relative quantitative assay，to avoid the effect of different vaginal sampling ways for determination results，and to investigate the role of Up in bacterial vaginosis(BV).MethodsThe primers and probes for Up were designed according to DNA topoisomeraseⅣgene sequences of 4 Up serovars to detect Up in vaginal secretion samples.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene was analyzed by PCR quantitative assay to determine host cells.The Up relative quantification was calculated as Up copies in 103host cells.Up standard isolate and clinical isolates，Ureaplasma urealyticum standard isolate and clinical isolates and 11 common vaginal microorganisms were determined to identify the specificity of the assay.The vaginal secretion samples were collected from 532 BV patients and 276 healthy women for the analysis of Up relative quantification.ResultsUp PCR quantitative assay had high sensitivity (100 copies/μL)，without amplification to Ureaplasma urealyticum and 11 other vaginal microorganisms.The infection rates of Up in BV patients and healthy women were 49.8%(265/532)and 43.1%(119/267)，respectively，without statistical significance(χ2=3.263，P=0.071).Up relative quantification in BV patients was 667 copies/103cells，which was significantly higher than that in healthy women(20 copies/103cells)(χ2=47.012，P=0.000 1).When using＞50 copies/103cells as a reference，the positive rate of Up in BV patients was 39.3%(209/532).It was significantly higher than that in healthy women(17.0%，47/276)(χ2=41.537，P=0.001).ConclusionsThe cell adhesion ability of Up is a key factor in the pathogenesis.Up PCR relative quantitative assay can overcome the influenceof different vaginal sampling ways on the determination results and objectively reflect the pathogenicity of Up.

Ureaplasma parvum;Polymerase chain reaction relative quantitative assay;Bacterial vaginosis

1673-8640(2015)09-0934-05

Q503

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.016

2015-05-18)

上海市衛(wèi)生局科研基金項目(2009245)

趙縝，男，1972年生，博士，副主任技師，主要從事脲原體致病機制的研究。

王偉業(yè)，聯(lián)系電話:021-25078882。